孟 姣，張存旭，孫 琳，戎旭旭

（西北農林科技大學 林學院，陜西 楊陵712100）

植物體細胞胚胎發(fā)生是指體細胞獲得胚狀體的過程，這一過程包括胚性愈傷組織的誘導、胚性組織的增值及保持、成熟培養(yǎng)和體胚植株的轉化及萌發(fā)幾個不同階段。在誘導階段，通常需要將植物材料置于控制條件下進行培養(yǎng)，促使細胞分化，形成胚性細胞。然而，在誘導過程中會出現2種不同類型的愈傷組織：一種為胚性愈傷組織，這種愈傷組織具有產生胚狀體的能力，生長較快，可通過體胚發(fā)生途徑再生植株；另一種為非胚性愈傷組織，它是具分生能力的一團不規(guī)則細胞，生長較慢，可通過器官發(fā)生途徑形成芽或根［1］。盡管這2種類型的愈傷組織通常根據其形態(tài)、顏色可加以區(qū)別，但在體胚發(fā)生中人們更關心的是體細胞如何轉變?yōu)榫吲咝阅芰Φ募毎?。為此，前人在生理生化機理方面進行了探討。研究發(fā)現胚性和非胚性愈傷組織在內源游離氨基酸、多胺、蛋白質、同工酶、淀粉含量及ADP-焦磷酸化酶等方面均存在差異［2］。Nieves對甘蔗胚性和非胚性愈傷組織的研究發(fā)現，胚性組織中腐胺／（亞精胺+精胺）的比值比非胚性的高［1］。對銀杉的研究發(fā)現，胚性組織中谷氨酸脫氫酶的活性顯著高于非胚性組織［3］。辛福梅［4］等人在對栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織抗氧化物酶活性的研究中發(fā)現，胚性組織中抗氧化物酶活性均明顯高于非胚性組織。以栓皮櫟的胚性和非胚性愈傷組織為試驗材料，通過對碳水化合物和酶活性的比較研究，分析2種愈傷組織的不同生化特性，以期為進一步建立愈傷組織的胚性發(fā)生能力與生化代謝間的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采集未成熟堅果，剝去殼斗，表面消毒后在無菌條件下剝取合子胚，撕掉膜質種皮，將裸露的合子胚以全胚胚根向下接種于誘導培養(yǎng)基上（MS基本培養(yǎng)基，附加0.5mg·L-16-BA，0.5mg·L-12，4-D和0.5mg·L-1PVP［5］），于 （25±1）℃ 暗 培 養(yǎng)。1個月后，將誘導出的愈傷組織轉接于增殖培養(yǎng)基上（MS基本培養(yǎng)基，附加1.0mg·L-16-BA，0.25 mg·L-1NAA，200mg·L-1水解酪蛋白和400mg·L-1谷氨酰胺［5］），16h光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)1個月。在體視顯微鏡下，根據顏色、形態(tài)、質地特征，分別選取胚性和非胚性愈傷組織，作為研究的材料（圖1）。

1.2 測定指標

1.2.1 可溶性糖含量 胚性和非胚性愈傷組織65℃烘干，分別稱取100mg，加入80%乙醇溶液，80℃水浴30min，3 500g離心10min，浸提3次，采用蒽酮比色法測定［6］。

圖1 （a）栓皮櫟胚性愈傷組織（色澤淺黃，質地較疏松，表面光滑，呈有光澤的顆粒狀或塊狀）（b）非胚性愈傷組織（米白色或淡綠色，質地較堅硬，表面粗糙干燥，呈無光澤的瘤狀）Fig.1 （a）embryogenic callus（pale yellow，loose texture，smooth surface，shiny，granule or block）and（b）non-embryogenic callus（beige or light green，hard texture，rough surface，dull，nodule）of Quercus variabilis

1.2.2 淀粉含量 向以上提取過可溶性糖的沉淀中加入2mL蒸餾水，沸水浴糊化15min，冷卻后加入2mL 9.2mol·L-1HClO4，4 000g 離心 10 min，浸提2次，采用蒽酮比色法測定［6］。

1.2.3 可溶性蛋白含量 胚性和非胚性愈傷組織65℃烘干，分別稱取100mg，加入少許石英砂和蒸餾水研磨，5 000g離心10min。上清液即為蛋白質提取液，采用考馬斯亮藍G-250染色法測定［6］。

1.2.4 水溶性蛋白分子量 分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重50mg，加入pH7.5的0.05M的磷酸鈉緩沖液300μL，研磨，15 000g離心10min，上清液即為水溶性蛋白提取液［7-8］。

電泳采用SDS-PAGE，10%的分離膠與5%的濃縮膠制板。進樣量每孔20μL，以溴酚蘭作為指示劑。恒壓電泳，當溴酚藍指示劑距膠底部2cm時，停止電泳，剝下膠片后，固定液中固定，考馬斯亮藍R-250染色過夜，脫色液中脫色并照相。

1.2.5 蛋白酶活性 分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重2 000mg。按1∶4比例加入pH7.0的磷酸緩沖液，研磨。4 000g離心10min，上清液為待測酶液。酶活力的測定采用福林-酚法［9］。

1.2.6 游離脯氨酸含量 分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重500mg，加入5mL 3%的磺基水楊酸溶液，沸水浴中提取15min，過濾。采用磺基水楊酸法測定［6］。

1.2.7 總多酚含量 參考李煥秀［10］的研究方法，并進行改進。分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重200mg，剪碎后進行研磨提取，提取液為50%的乙醇（pH=3.0），充分提取后過濾，濾液用于測定總多酚的含量。檢測波長為270nm，以鄰苯二酚作標準曲線，計算每克鮮樣中總酚的毫克數。

1.3 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復3次，在SPSS 17.0中對數據進行統(tǒng)計處理。采用t檢驗對2種類型愈傷組織生化指標含量進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 可溶性糖含量的差異

糖是高等植物物質轉化的一種重要形式，在植物體內的含量和種類極其豐富，對植物的生長發(fā)育具有重要作用?？扇苄蕴遣粌H作為滲透調節(jié)劑影響體細胞胚胎的誘導和發(fā)育，而且作為一種能源物質為細胞代謝提供能量。

栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織可溶性糖含量測定結果見表1，結果顯示栓皮櫟胚性愈傷組織可溶性糖含量為97.6mg·g-1，顯著高于非胚性愈傷組織可溶性糖含量。

表1 栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織生化特性及t測驗Table 1 Mean values of biochemical character and t-test of embryogenic and non-embryogenic calli

2.2 淀粉含量的差異

淀粉是一種天然多糖化合物，以淀粉顆粒的形式廣泛存在于植物的果實、根、莖、葉中。作為植物體內最普遍的一類儲藏物質，積極參與組織培養(yǎng)過程和形態(tài)建成，其消長與組織分化及器官形成具有密切的關系。從表1可以看出，栓皮櫟胚性愈傷組織的淀粉含量為25.3mg·g-1，顯著大于非胚性愈傷組織。

2.3 可溶性蛋白含量的差異和譜型分析

蛋白質是生命的物質基礎，在細胞和生物體的生命活動過程中，起著十分重要的作用。可溶性蛋白質作為重要的儲藏物質，在體細胞胚胎發(fā)生過程中具有重要的研究意義。從表1可以看出，栓皮櫟胚性愈傷組織可溶性蛋白質的含量顯著大于非胚性愈傷組織，兩者相差約1倍。

從SDS-PAGE電泳圖譜分析可知（圖2），胚性愈傷組織中蛋白條帶數比非胚性的多，且染色較深。兩者共有的條帶分子量分別為122、69、62.5、53.1 KD和33.7KD，但分子量為66.2、43.1KD和41.1 KD的蛋白條帶僅出現在胚性愈傷組織，在非胚性愈傷組織未發(fā)現特有蛋白條帶。

圖2 可溶性蛋白電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of soluble protein

2.4 蛋白酶酶活的差異

蛋白酶廣泛存在于植物中，蛋白酶中含有多種不同蛋白水解酶組分，對多種蛋白質及多肽具有催化水解活性，蛋白酶酶活是細胞代謝活動的一個重要指標。

栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織蛋白酶酶活的測定結果（表1）顯示，栓皮櫟胚性組織中蛋白酶酶活為0.231U·mg-1，非胚性的蛋白酶酶活為0.228 U·mg-1。可見，栓皮櫟胚性組織的蛋白酶酶活高于非胚性，但是未達到顯著水平。

2.5 游離脯氨酸含量的差異

脯氨酸是植物體內重要的滲透性調節(jié)物質，可以作為活性氧的清除劑，還具有降低細胞內酸度、調節(jié)氧化還原電勢以及作為細胞內酶的保護劑等作用。由表1可以看出，栓皮櫟胚性組織中游離脯氨酸含量顯著高于非胚性。

2.6 總多酚含量的差異

多酚類物質包括酚酸、黃酮、花青素、單寧、兒茶素等，是植物的酚類次生代謝產物。由表1可知，栓皮櫟非胚性愈傷組織的總多酚含量為3.3mg·g-1，顯著高于胚性愈傷組織。

3 結論與討論

植物體細胞胚胎的發(fā)生需要經過幾個不同的階段，每個階段都伴隨著一系列生理生化變化，這些變化在形態(tài)轉變之前即已發(fā)生。栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織在顏色、質地、形態(tài)方面的差異與其組織內部物質變化有密切的聯系。

體胚中可溶性糖含量水平標志著源端的同化物供應能力和庫端對同化物的轉化、利用能力。因此可溶性糖在植物的體細胞胚胎發(fā)生中具有重要作用。栓皮櫟胚性組織可溶性糖含量顯著高于非胚性組織說明：胚性組織新陳代謝速率高于非胚型愈傷組織，高含量的可溶性糖為胚型愈傷組織分化產生胚胎提供物質和能量基礎。本研究結果與Nieves等人在甘蔗中的報道一致［2］，但與張獻龍［11］等在陸地棉中的研究結果不相符。張獻龍［11］等研究顯示陸地棉胚性組織的可溶性糖含量低于非胚性，但胚性組織的蛋白質和RNA含量高于非胚性。該結果說明胚性愈傷組織代謝旺盛，能及時把從培養(yǎng)基獲得的糖分轉化成細胞分裂和分化所必需的RNA和蛋白質。這2種不同結果的可能原因是取樣的時間不同。本試驗和Nieves的試驗都是在誘導2個月后取樣，而張獻龍［11］等人是在3個月后取樣。李茜［12］等人對白皮松愈傷組織生理生化特性的研究表明，在體細胞誘導過程中，胚性組織可溶性糖的含量會在一段時間后出現一個高峰，隨后含量會下降而低于非胚性組織，因此取樣時間對試驗結果有重要的影響。

研究表明淀粉含量與胚胎發(fā)生能力呈正相關［13］。栓皮櫟胚性組織的淀粉含量顯著大于非胚性，說明胚性細胞胚胎發(fā)生能力強。對馬唐愈傷組織的組織學觀察表明，胚性組織中淀粉粒多，非胚性中淀粉粒很少，兩者相差10～40倍［2］。此外，對馬唐淀粉酶的研究表明胚性組織中淀粉酶種類多、活力高，則能催化較多的淀粉水解，以保證糖代謝的底物供應，為胚胎發(fā)生提供物質和能量基礎。這與本研究中栓皮櫟胚性組織的淀粉含量高于非胚性的結果相符。

栓皮櫟胚性組織可溶性蛋白質的含量約為非胚性組織的2倍。表明胚性組織中蛋白質合成較旺盛，非胚性中蛋白質合成較少。

分子量為122、69、62.5、53.1KD和33.7KD等的蛋白質條帶在2種愈傷組織中均有出現，說明這些蛋白可能是對細胞結構建成很重要的蛋白。分子量為66.2、43.1KD和41.1KD等的蛋白質只在胚性組織中出現或在非胚性中含量很低，說明這部分蛋白與體胚發(fā)生過程密切相關，可能是催過該過程的重要酶類。齊力旺［14］等研究表明胚性組織中游離氨基酸含量低于非胚性，胚性組織中游離氨基酸庫較小，非胚性的游離氨基酸庫較大，說明胚性組織能將大量的游離氨基酸轉變?yōu)榈鞍踪|以備細胞分化之用。

栓皮櫟2種愈傷組織蛋白酶活的測定結果與Nieves［2］等在甘蔗中的報道一致，甘蔗胚性愈傷組織蛋白水解酶酶活為0.3U·mg-1，非胚性的蛋白水解酶酶活為0.2U·mg-1，未達到顯著差異水平。胚性組織中高活性的蛋白酶有利于蛋白質的降解，為新蛋白質的合成提供氨基酸，為愈傷組織的快速生長和體胚發(fā)生提供物質條件。

H2O2作為活性氧的一種重要形式，是細胞有氧代謝的產物。微量的H2O2可在生物體的生理過程中發(fā)揮重要的調控作用，特別是在細胞內信號轉導方面，但過量的H2O2具有損傷生物大分子、毒害細胞的效應。滲透性調節(jié)物脯氨酸作為活性氧的清除劑是植物對逆境脅迫的一種適應和保護措施。胚性組織游離脯氨酸含量顯著高于非胚性，說明胚性細胞的蛋白質、核酸、酶、脂膜的穩(wěn)定性高于非胚性，適應性、抗逆性較非胚性強，為下一步體細胞胚胎的的產生創(chuàng)造了有利條件。研究表明作為另一類活性氧的清除劑，栓皮櫟胚性組織中過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性也顯著高于非胚性［4］。

多酚的主要功能是抗氧化，清除自由基。A.M.Maira［15］等進行花卉組培時發(fā)現酚類物質的含量與其褐變率成正相關，而褐變會抑制愈傷組織的生長甚至導致死亡。相關研究表明多酚氧化酶在非胚性愈傷組織中表現出較高的活性［12］，多酚類化合物氧化產生的醌類物質使非胚性組織代謝減弱、膜透性增加，從而抑制細胞分化、導致生長緩慢、胚胎發(fā)生能力弱。N.Nieves［1］等研究表明沒食子酸是2種類型愈傷組織中最主要的酚酸，而且沒食子酸在非胚性組織中的含量顯著高于胚性，這與本試驗結果一致。

本研究通過對栓皮櫟胚性和非胚性組織生理生化特性的比較發(fā)現胚性愈傷組織的物質代謝活性遠高于非胚性組織，為體胚的發(fā)生提供物質和能量基礎。本試驗初步揭示了植物體細胞胚胎發(fā)生的生化基礎，為建立愈傷組織的胚性發(fā)生能力與生化代謝間的關系提供了依據。但要進一步揭示植物體細胞胚胎發(fā)生的機理需要探討其分子基礎，掌握細胞分化過程中有關蛋白質和酶的動態(tài)變化規(guī)律。

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