吳文輝 梁保紅 楊辰懿 張喜 李鵬飛

【摘要】超氧化物歧化酶（Superoxide Dimutese，SOD）是一種以金屬元素為輔基的蛋白酶，主要功能是清除生物體內(nèi)由正常代謝產(chǎn)生的有害自由基。本課題SOD的提取來(lái)源為酵母，由于酵母細(xì)胞不存在被污染的情況，因此將酵母細(xì)胞作為SOD的提取源，相較于從牲畜血液中提取有著更方便、高效、安全的優(yōu)點(diǎn)。本文主要對(duì)從酵母細(xì)胞中提取超氧化物歧化酶（SOD）的工藝進(jìn)行研究，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中尋找更易提取SOD的方法以及如何提取出活性更強(qiáng)的SOD。

【關(guān)鍵詞】超氧化物歧化酶；酵母菌；發(fā)酵法；超聲波細(xì)胞破碎提取

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.02.033

Study on Extraction of Superoxide Dismutase From Yeast Cells

WU Wenhui，LIANG Baohong，YANG Chenyi，ZHANG Xi，LI Pengfei

（Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，China）

Abstract：Superoxide dismutase（SOD）is a kind of protease with metal elements as the cofactor，whose main function is to remove harmful free radicals produced by normal metabolism in the organism. The source of SOD extraction in this project is yeast. Since yeast cells are not contaminated，it is convenient，efficient and safe to use yeast cells as the source of SOD extraction compared with the extraction from livestock blood. In this paper，the technology of extracting superoxide dismutase（SOD）from yeast cells was studied，and the method of extracting SOD more easily and how to extract SOD with stronger activity were found in the experiment process.

Key words：superoxide dismutase；saccharomycetes；zymotechnics；ultrasonic cell crushing extraction

1緒論

1.1酵母和YEPD培養(yǎng)基

酵母泛指能發(fā)酵糖類的各種單細(xì)胞真菌，主要生長(zhǎng)在偏酸性環(huán)境當(dāng)中，對(duì)水分和含糖量有一定的要求，是一種典型的異養(yǎng)兼性厭氧微生物，在有氧和無(wú)氧條件下都能夠生存，分布范圍廣。

酵母菌的適宜pH值范圍為3.1～7.4，最適pH值為4.6～ 5.1，最適生長(zhǎng)溫度一般在30℃左右。在有氧情況下，酵母菌可以把糖分解成CO2和H2O，同時(shí)在該情況下生長(zhǎng)繁殖速度較快；在缺氧情況下，其生長(zhǎng)繁殖速度受到限制，在該情況下可以把糖分解成乙醇和CO2。

酵母作為兼性厭氧微生物，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的超氧化物歧化酶，能夠催化代謝過(guò)程中產(chǎn)生的各種自由基，將其歧化生成水和氧氣，來(lái)減輕對(duì)細(xì)胞造成的損害[1]。同時(shí)酵母分布廣泛，容易生長(zhǎng)，相較于從血液中提取SOD，將酵母細(xì)胞作為提取源具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YEPD培養(yǎng)基）是專門(mén)用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基，其配方為：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制備固體培養(yǎng)基，需加入2%瓊脂粉[2]。

葡萄糖在高溫條件下易產(chǎn)生焦糖，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，因此將葡萄糖和其他成分分開(kāi)配制，在不同條件條件下滅菌，最后混合得到Y(jié)EPD培養(yǎng)基。

具體配制方法：用適量水溶解規(guī)定量的酵母浸粉和蛋白胨，在0.1 MPa、121℃的條件下高壓蒸汽滅菌15 min，然后用適量水溶解規(guī)定量的葡萄糖，在0.1 MPa、115℃條件下高壓蒸汽滅菌15 min。最后將兩種滅菌完成的溶液混合，得到Y(jié)EPD培養(yǎng)基。

1.2超聲波細(xì)胞破碎提取技術(shù)

本實(shí)驗(yàn)采取超聲波細(xì)胞破碎技術(shù)將酵母細(xì)胞破碎，從中提取SOD。所用儀器為超聲波細(xì)胞破碎儀，其原理是利用超聲波作用產(chǎn)生的能量使細(xì)胞等物質(zhì)破碎[3]。

該細(xì)胞破碎方法具有操作簡(jiǎn)便、變量容易控制的特點(diǎn)，通過(guò)破碎時(shí)間和破碎功率影響最終SOD的活性，也是該實(shí)驗(yàn)主要探究的影響因素。

1.3鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)SOD活性

自有活性的SOD以來(lái)，產(chǎn)生了許多測(cè)定SOD活性的方法，其中以化學(xué)法最為常用。鄰苯三酚法是一種通過(guò)吸光度值的變化速率來(lái)間接測(cè)定SOD活性的簡(jiǎn)便方法，在國(guó)內(nèi)外得以廣泛應(yīng)用。與其他方法相比，鄰苯三酚自氧化法具有操作簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)?；驹硎?，鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境中會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的超氧陰離子自由基生成有色的中間產(chǎn)物，導(dǎo)致吸光度值增加，吸光度值與反應(yīng)時(shí)間兩者呈線性關(guān)系。加入SOD后，催化超氧陰離子自由基生成過(guò)氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生成減少，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧化的速率降低，則可以通過(guò)樣品SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率的程度來(lái)間接得到樣品SOD的活性[4]。

1.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交表

當(dāng)實(shí)驗(yàn)理論需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)次數(shù)太多時(shí)，通過(guò)有效的手段減少試驗(yàn)次數(shù)變得尤為重要，不僅可以減少工作量，也可以提高試驗(yàn)的效率。選擇一部分有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn)，由此出現(xiàn)了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Orthogonal experimental design）是在研究多因素多水平實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，為了提高效率，設(shè)計(jì)出的一種實(shí)驗(yàn)方法。它是根據(jù)一定的數(shù)據(jù)特性，從原有試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)作為一種高效、實(shí)用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究領(lǐng)域。

根據(jù)正交試驗(yàn)選擇的水平，相互組合成表格，稱為正交表。通常用LA（B^C）的形式表示，A為試驗(yàn)次數(shù)，B為因子的水平數(shù)，C為因子的個(gè)數(shù)。比如該實(shí)驗(yàn)中采用的正交表形式為L(zhǎng)9（3⁴），即有4個(gè)實(shí)驗(yàn)因子，每個(gè)因子有3個(gè)水平，總共進(jìn)行9次實(shí)驗(yàn)[5]。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1實(shí)驗(yàn)所用試劑和儀器設(shè)備

2.1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑（見(jiàn)表1）

2.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備（見(jiàn)表2）

除此之外還有電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、pH計(jì)等儀器。

2.2YEPD培養(yǎng)基的制備

1）稱取ZnSO4·7H2O 0.3 g，CuSO4·5H2O 0.25 g分別配制成100 mL的溶液。2）用適量水完全溶解8 g酵母浸粉，16 g蛋白胨，然后分別加入1 mL步驟1的兩種溶液，最后用水定容至720 mL，移入四個(gè)三角燒瓶?jī)?nèi)（培養(yǎng)基量分別為180 mL、180 mL、180 mL、90 mL）。外包報(bào)紙，便于透氣同時(shí)防止雜菌污染，并用皮筋扎好。3）適量水完全溶解20 g葡萄糖，然后用水定容至100 mL。4）將步驟2）培養(yǎng)基0.1 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌15 min（同時(shí)滅菌一根試管），將步驟3）培養(yǎng)基0.1 MPa、115℃高壓蒸汽滅菌15 min。5）將滅菌后的步驟3）培養(yǎng)基分四次（分別為20 mL、20 mL、20 mL、10 mL）平均加入四個(gè)步驟2）的三角燒瓶培養(yǎng)基內(nèi)并混合，得到Y(jié)EPD培養(yǎng)基。

2.3酵母細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

1）將一定量酵母接種在YEPD培養(yǎng)基上，在30℃溫室中靜置培養(yǎng)。每次吸取2 mL左右培養(yǎng)液加入新培養(yǎng)基中，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，活化3代。2）將1 mL菌液接于YEPD培養(yǎng)基試管中（5 mL），在30℃溫室中靜置培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基三角燒瓶中，30℃搖床（140 r/min）培養(yǎng)。3）5000 r/min離心5 min，棄去上清液，用水反復(fù)清洗沉淀，再次離心，收集細(xì)胞[6]。

2.4SOD的提取

2.4.1試劑配制

磷酸緩沖溶液（含0.1 mol/L的EDTA），A液：取Na2HPO4 35.9 g，加水溶解，并稀釋至500 mL。B液：取NaH2PO4 2.76 g，加水溶解，并稀釋至1000 mL。

取A液91.5 mL，B液8.5 mL，再加入2.9 g EDTA，混合即得pH值為7.8的磷酸緩沖溶液。

2.4.2提取方法

用30 mL磷酸緩沖溶液溶解酵母細(xì)胞，利用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，設(shè)定功率和提取時(shí)間，工作2秒，休息8秒，進(jìn)行細(xì)胞破碎。最后，5000 r/min離心25 min，收集上清液后進(jìn)行過(guò)濾，得到SOD粗提液。

2.5SOD活性檢測(cè)

2.5.1試劑配制

1）鄰苯三酚溶液：稱取鄰苯三酚0.57 g，用10 mmol/L的鹽酸溶液（0.2 mol/L的HCl 5 mL稀釋至100 mL）配制成100 mL溶液。2）Tris-HCI-EDTA緩沖液（pH值為8.2，內(nèi)含2 mmol/L EDTA）：稱取2.4 g Tris和0.12 g EDTA配制成100 mL溶液，與44.76 mL 0.2 mol/L的鹽酸溶液（12 mol/L的HCl 16.6mL稀釋至1L）混合，加蒸餾水至200 mL，調(diào)pH值為8.2。

2.5.2測(cè)定操作

1）鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定

按表3中試劑用量加入，Tris-HCI-EDTA緩沖液和蒸餾水25℃保溫20 min，然后與相同條件保溫的鄰苯三酚溶液混合（空白對(duì)照以相同條件保溫）混勻后迅速置于比色杯中，在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，每隔30 s測(cè)一次光密度值，共測(cè)4 min[4]。

2）SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定

按表4中試劑用量加入，Tris-HCI-EDTA緩沖液、SOD粗提液和蒸餾水25℃保溫20 min，其余操作同上。

2.5.3活性計(jì)算

2.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交表（見(jiàn)表5，表6）

3結(jié)果與分析

經(jīng)多次測(cè)定，最終取平均值可得鄰苯三酚自氧化速率ODA=0.036。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表7。

從表中可以看出：從K值來(lái)看，最優(yōu)的組合為t1 24 h、t2 15 h、t3 15 min和ω300 w，但這并未在實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，最優(yōu)組合是第五組，即t1 24 h、t2 15 h、t3 25 min和ω300 w。因此，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證這兩個(gè)組合的優(yōu)劣。從R值來(lái)看，其值越大代表該因素越重要。因此，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，在此四種因素當(dāng)中，最重要的因素是t2（搖床培養(yǎng)的時(shí)間），其次是t1（活化與靜置培養(yǎng)時(shí)間）、t3（提取時(shí)間）和ω（提取功率），且后面三種因素的重要程度差別不大。再?gòu)腒值的角度分析，t2的最適時(shí)間為15 h，適當(dāng)提高ω和t3有助于產(chǎn)物SOD單位活力的增加，同時(shí)t1過(guò)高會(huì)降低產(chǎn)物SOD的單位活力，應(yīng)該維持在24 h左右。

4結(jié)論

1）理論最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合為t1（活化與靜置培養(yǎng)時(shí)間）24 h、t2（搖床培養(yǎng)的時(shí)間）15 h、t3（提取時(shí)間）15 min和ω（提取功率）300 w。2）在此四種因素當(dāng)中，最重要的因素是t2（搖床培養(yǎng)的時(shí)間），其次是t1（活化與靜置培養(yǎng)時(shí)間）、t3（提取時(shí)間）和ω（提取功率），且后面三種因素的重要程度差別不大。3）最重要的因素，即t2的最適時(shí)間為15 h，適當(dāng)提高ω和t3有助于產(chǎn)物SOD單位活力的增加。4）應(yīng)該注意t1過(guò)高會(huì)降低產(chǎn)物 SOD的單位活力，應(yīng)該維持在24 h左右。

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【作者簡(jiǎn)介】

吳文輝，男，2001年出生，本科在讀，專業(yè)方向?yàn)榄h(huán)境與安全工程系生物工程專業(yè)。

（編輯：侯睿琪）