蔡沾煥,陳 升,王艷良（儋州市人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬儋州醫(yī)院普通外科，海南 儋州 571700）

幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）可以觸發(fā)胃部的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[1]。Hp感染與胃癌發(fā)病密切相關(guān)，因此尋找與Hp 感染相關(guān)的指標(biāo)對(duì)指導(dǎo)胃癌的治療具有重要意義。有研究證實(shí)，miRNA 表達(dá)水平的變化會(huì)引起胃癌發(fā)生，與胃黏膜細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞中miR-375 表達(dá)較低，且Hp 感染后miR-375 表達(dá)下調(diào)，表明miR-375 在Hp 感染胃癌中起重要作用[2-3]。研究表明，下調(diào)miR-375可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖[4]。硫酸軟骨素酶1（chondroitin sulfate synthase 1，CHSY1）參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[5]。臨床組織樣本的免疫組化分析和公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)挖掘顯示，CHSY1 在胃癌中顯著上調(diào)，且與腫瘤分期較晚、預(yù)后較差相關(guān)[6]。然而，目前對(duì)于胃癌患者miR-375 和CHSY1 表達(dá)與Hp 感染的關(guān)系還未完全闡明，本研究通過(guò)分析胃癌患者血清中miR-375和CHSY1的表達(dá)水平，探討二者與Hp感染的相關(guān)性，以期為胃癌患者的早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018 年6 月至2021 年6 月我院收治的胃癌患者96例設(shè)為胃癌組，另選取同期在我院就診的慢性淺表性胃炎患者68例設(shè)為對(duì)照組。2組患者一般資料無(wú)顯著差異（P＞0.05），具有可比性。胃癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《胃癌:診斷和治療方案的選擇》[7]的標(biāo)準(zhǔn)；②首次確診為胃癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②近3 個(gè)月有外科手術(shù)、放射治療或內(nèi)窺鏡手術(shù)史；③具有炎癥性疾病或免疫性疾病；④近6個(gè)月服用過(guò)抗生素或抗炎、胃黏膜保護(hù)類(lèi)藥物。本研究已經(jīng)通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（18-00516），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 Hp感染檢測(cè)

采用13C 呼氣試驗(yàn)測(cè)定清晨空腹?fàn)顟B(tài)下所有患者Hp 感染情況?？崭狗?3C 尿素膠囊30 min 后通過(guò)紅外光譜儀進(jìn)行呼氣，呼出氣體中13C原子峰大于基線5%時(shí)即為Hp陽(yáng)性感染[8]。

Hp 感染密度檢測(cè)[9]：在術(shù)中取適量胃癌患者距離幽門(mén)2 cm 的胃黏膜組織，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理診斷，油鏡下根據(jù)Hp 的感染密度將患者分為Hp 輕度組（輕度Hp感染，密度≤1/3）、Hp中度組（中度Hp感染，密度＞1/3～＜2/3）、Hp重度組（重度Hp感染，密度≥2/3）。

1.3 miR-375和CHSY1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

分別采集胃癌組患者入院后第2天清晨和對(duì)照組患者就診當(dāng)日清晨空腹靜脈血3 mL，離心，分離上清，將血清儲(chǔ)存于-80 ℃，避免反復(fù)凍融。利用TRIzol 試劑提取血清總RNA。利用PrimeScript RT 試劑盒合成cDNA。qRT-PCR 分析miR-375 和CHSY1 mRNA 的表達(dá)水平，采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。反應(yīng)體系共12 μL：miScript SYBR?Green Mix 6 μL，cDNA 1 μL，上下引物各0.8 μL，ddH2O 3.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。分別以U6、GAPDH 為內(nèi)參。本研究引物由北京擎科生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Spearman相關(guān)性分析血清中miR-375 和CHSY1 表達(dá)水平與胃癌患者Hp感染的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp感染檢測(cè)結(jié)果

胃癌組96 例患者中，Hp 陽(yáng)性81 例（84.38%）；對(duì)照組68 例患者中，Hp 陽(yáng)性30 例（44.12%）。胃癌組Hp感染陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(χ2=29.493,P＜0.001)。

2.2 miR-375和CHSY1 mRNA表達(dá)水平比較

胃癌組Hp 陰性及Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-375 表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），CHSY1 mRNA 表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.001）。胃癌組及對(duì)照組Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-375 表達(dá)水平低于Hp 陰性患者（P＜0.05），CHSY1 mRNA 表達(dá)水平高于Hp 陰性患者（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 miR-375和CHSY1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 miR-375和CHSY1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

*：與Hp陰性miR-375比較，P＜0.05；#：與Hp陰性CHSY1比較，P＜0.05

組別胃癌組對(duì)照組t P n 96 68 Hp陰性miR-375 0.88±0.12 0.95±0.08 2.476 0.017 CHSY1 1.25±0.13 1.12±0.06 5.007＜0.001 Hp陽(yáng)性miR-375 0.76±0.08*0.85±0.15*4.074＜0.001 CHSY1 1.48±0.24#1.26±0.12#4.794＜0.001

2.3 不同Hp 感染患者血清中miR-375 和CHSY1 mRNA表達(dá)水平

油鏡結(jié)果顯示，8 例Hp 陽(yáng)性感染胃癌患者Hp 輕度感染25 例，Hp 中度感染30 例，Hp 重度感染26 例。Hp陽(yáng)性患者隨著Hp的感染程度增加，miR-375的表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)（P＜0.05），CHSY1 mRNA 的表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同Hp 感染患者血清中miR-375 和CHSY1 mRNA 表達(dá)水平（±s）

表3 不同Hp 感染患者血清中miR-375 和CHSY1 mRNA 表達(dá)水平（±s）

*：與Hp輕度組比較，P＜0.05；#：與Hp中度組比較，P＜0.05

組別Hp輕度組Hp中度組Hp重度組F P n 25 30 26 miR-375 0.86±0.09 0.75±0.08*0.66±0.07*#39.662＜0.001 CHSY1 1.26±0.24 1.48±0.24*1.68±0.23*#20.046＜0.001

2.4 胃癌患者Hp 感染與血清miR-375 和CHSY1 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清中miR-375表達(dá)水平與胃癌患者Hp 感染呈負(fù)相關(guān)（r=-0.648，P＜0.001），血清中CHSY1 表達(dá)水平與胃癌患者Hp 感染呈正相關(guān)（r=0.534，P＜0.001）。

3 討論

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，進(jìn)展快，預(yù)后差。全世界約有40 億人感染Hp，其在復(fù)雜的胃環(huán)境中定居可破壞胃黏膜，導(dǎo)致宿主胃部炎癥反應(yīng)，引起消化性潰瘍和慢性胃炎甚至是胃癌[10-11]。因此，尋找與胃癌患者Hp 感染有關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)于胃癌的早期臨床治療和預(yù)防具有重要的意義。

胃癌中miR-375 的表達(dá)較胃炎下調(diào)，且Hp 感染下的胃上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中miR-375 表達(dá)下調(diào)[4,12]。miR-375 已被證明可通過(guò)JAK2-STAT3 信號(hào)通路調(diào)控胃癌組織中PD-L1 的表達(dá)，從而調(diào)控癌癥轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組Hp 陰性及Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-375 表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，且胃癌組及對(duì)照組Hp 陽(yáng)性患者血清中miR-375 表達(dá)水平低于Hp陰性患者，與以往研究結(jié)果一致[12]，提示miR-375 表達(dá)水平對(duì)Hp 感染胃癌患者的評(píng)估具有重要意義。同時(shí)，本研究Spearman相關(guān)性分析顯示胃癌患者血清中miR-375 表達(dá)水平與Hp 感染呈負(fù)相關(guān)，提示miR-375水平與Hp 感染密切相關(guān)，檢測(cè)miR-375表達(dá)水平有助于預(yù)測(cè)Hp 感染的發(fā)生，從而可對(duì)Hp 感染胃癌患者進(jìn)行早期預(yù)防及治療。

CHSY1 是一種介導(dǎo)硫酸軟骨素聚合步驟的酶[14]。有研究表明，CHSY1 基因敲除可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。CHSY1 基因敲除的胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性降低，腫瘤生長(zhǎng)減慢[15]。CHSY1 對(duì)于胃癌的發(fā)生具有促進(jìn)作用，可作為判斷患者預(yù)后的新指標(biāo)，以及胃癌治療的新靶點(diǎn)[7,16]。有研究發(fā)現(xiàn)，CHSY1 在肝細(xì)胞癌中頻繁上調(diào)，可增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組Hp 陰性及Hp 陽(yáng)性患者血清CHSY1 表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，且胃癌組及對(duì)照組Hp 陽(yáng)性患者血清中CHSY1 表達(dá)水平高于Hp 陰性患者，推測(cè)CHSY1 可能發(fā)生促癌作用，且其表達(dá)與胃癌患者Hp 感染有關(guān)。同時(shí)，本研究Spearman相關(guān)性分析顯示血清中CHSY1表達(dá)水平與胃癌患者Hp 感染呈正相關(guān)，表明胃癌患者Hp感染與CHSY1表達(dá)水平有關(guān)，其有望成為胃癌患者Hp感染相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，在胃癌患者血清中miR-375 表達(dá)水平降低，CHSY1表達(dá)水平升高，miR-375表達(dá)與胃癌患者Hp 感染嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，CHSY1 表達(dá)與Hp 感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。但由于本研究樣本量較少，研究結(jié)果有待更多研究來(lái)證實(shí)。