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        髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料、VEGF 對股骨頭壞死家兔骨密度及生物力學的影響

        2023-07-20 02:12:26呂亞軍李宜炯趙振拴張宇宸河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院骨二科河北石家莊050031
        局解手術學雜志 2023年7期
        關鍵詞:松質骨家兔膠原

        呂亞軍,李宜炯,趙振拴,張宇宸,王 偉(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院骨二科,河北 石家莊 050031)

        股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)是一種發(fā)病率和致殘率較高的常見骨科疾病[1],其發(fā)病機制復雜,目前尚缺乏可靠的治療方法[2-3]。髓芯減壓治療ONFH 療效較為確切,可有效降低骨內壓力并延緩疾病進展[4],但易受到骨壞死位置和范圍限制[4]。植骨是髓芯減壓治療后的重要步驟,主要用于填充髓芯減壓治療后形成的空腔。膠原基骨修復材料是植骨的理想材料,其成分類似于天然骨,具有誘導成骨、可降解、易塑形、無免疫原性等特性,比天然骨更利于骨修復[5-6]。血管再生是骨修復的關鍵環(huán)節(jié)[7]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)可吸引內皮細胞和破骨細胞,促進成骨細胞分化,在骨修復過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。骨密度及生物力學是評價骨形成和修復的主要指標。本研究首次開發(fā)了髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料、VEGF治療ONFH的新型復合療法,并建立家兔ONFH模型,觀察該復合療法對家兔ONFH 模型骨密度及生物力學的影響,以期為ONFH的治療提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 動物

        30 只SPF 級家兔購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心[動物生產許可證號:SCXN(冀)2013-1-003],6月齡,體質量(2.21±0.29)kg。飼養(yǎng)條件:25 ℃、60%相對濕度、12 h 晝夜交替。飼養(yǎng)期間不限制進食及飲水。本研究已獲得河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(ZD20140210)。

        1.2 動物模型的建立

        參考文獻[11]構建家兔ONFH 模型。麻醉家兔并俯臥位固定,剪開大轉子外側筋膜和皮膚,鈍性分離轉子間的肌肉,X 射線引導下于大轉子外側穿刺至股骨頭中心,克氏針擴髓,將1 mL 的無水乙醇注射至左側股骨頭中心,速度為0.1 mL/min(圖1a)。造模6 周后CT 掃描觀察到股骨頭壞死、骨密度增高、股骨頭外形改變等特征為建模成功(圖1b)。

        圖1 動物模型的建立

        1.3 動物分組和治療

        將30 只家兔隨機分為健康對照組(A 組)、模型組(B 組)、髓芯減壓聯(lián)合自體松質骨組(C 組)、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料組(D組)及髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料和VEGF 組(E 組),每組6 只。A 組為未建模的家兔,B 組家兔建模后正常飼養(yǎng),不進行治療;C 組在髓芯減壓基礎上植入自體松質骨;D 組在髓芯減壓基礎上植入膠原基骨修復材料(天津市賽寧生物工程技術有限公司);E 組在髓芯減壓基礎上植入吸附有VEGF(約500 ng)的膠原基骨修復材料。各組在干預8周后進行后續(xù)實驗。

        1.4 骨密度的測量

        40 mg/kg 的硫噴妥鈉腹腔注射麻醉家兔后固定,應用骨密度分析系統(tǒng)(QCT PRO V6.1)測定并分析骨密度。

        1.5 組織病理學染色

        C 組、D 組和E 組ONFH 模型家兔干預8 周后,用40 mg/kg 的硫噴妥鈉腹腔注射麻醉家兔,用空氣栓塞法處死,取出股骨頭,EDTA 脫鈣后制作5 mm 厚石蠟切片,進行HE染色。隨機選取10個高倍視野,每個視野計數(shù)50 個骨陷窩??展窍莞C比率=空骨陷窩數(shù)/總骨陷窩數(shù)×100%。

        1.6 生物力學測量

        分離股骨頭,用ETM103A微機控制電子萬能試驗機測量最大應力(N/mm2)、彈性模量(kPa)、剛度(N/mm)、最大載荷(N)和能量吸收(N.mm)。

        1.7 qRT-PCR

        將股骨頭標本放入液氮中,取出后移至液氮預冷的研缽中研磨成粉末,然后用TRIzol 試劑(美國Thermo Fisher)提取總RNA。使用SuperScrip IV 逆轉錄酶(美國Thermo Fisher)進行逆轉錄,使用PowerUp SYBR Green Master Mix(美國Thermo Fisher)在熒光定量PCR 儀上進行PCR。骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、血管內皮生長因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)、血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)、核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)和GAPDH 引物序列見表1,擴增條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,40個循環(huán)。以GAPDH 為內參基因,引物序列見表1,用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

        表1 引物序列

        1.8 統(tǒng)計學分析

        使用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析進行多組間比較,采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 各組家兔的一般情況觀察

        本研究過程中無家兔死亡。A 組家兔精神狀態(tài)正常,皮毛光澤,正常運動。B 組家兔精神萎靡,皮毛無光澤,行動遲緩,彈跳能力降低。C組、D組和E組家兔精神狀態(tài)較B 組改善,皮毛恢復光澤,運動能力增加,其中E組家兔的一般情況優(yōu)于其他組。

        2.2 各組家兔的股骨頭骨密度

        各組家兔的股骨頭骨密度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與A 組相比,B 組的骨密度顯著降低(P<0.05);與B組相比,C組、D組和E組的骨密度均顯著升高(P<0.05);E 組的骨密度顯著高于C 組和D 組(P<0.05),見圖2。

        圖2 各組家兔的骨密度

        2.3 各組家兔的股骨頭組織病理學變化

        治療8周后,A 組家兔股骨頭組織形態(tài)正常。B組股骨頭組織骨小梁錯亂且數(shù)量較少,血管數(shù)量也較少。與B 組相比,C 組、D 組和E 組骨小梁錯亂明顯改善,骨小梁增多,骨髓中血管形成明顯增多。E 組股骨頭組織修復情況明顯優(yōu)于其他組。各組空骨陷窩比率差異有統(tǒng)計學意義(F=21.340,P<0.001)。與A 組相比,B 組的空骨陷窩比率顯著增多(P<0.05);與B 組相比,C 組、D 組和E 組的空骨陷窩比率均降低(P<0.05);E 組的空骨陷窩比率低于C 組和D 組(P<0.05),見圖3。

        圖3 各組家兔股骨頭組織的HE染色

        2.4 各組家兔的股骨頭生物力學參數(shù)變化

        各組家兔的股骨頭生物力學參數(shù)(最大應力、彈性模量、剛度、最大載荷和能量吸收)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與A組相比,B組的股骨頭生物力學參數(shù)均顯著降低(P<0.05);與B組相比,C組、D組和E組的股骨頭生物力學參數(shù)均升高(P<0.05);E組的股骨頭生物力學參數(shù)均高于C組和D組(P<0.05),見表2。

        表2 各組家兔的股骨頭生物力學參數(shù)

        2.5 各組家兔的股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL和RANK的表達

        各組家兔股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL 和RANK 的mRNA 水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與A相比,B組股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL 和RANK 的mRNA表達均增加(P<0.05);與B組相比,C組、D組和E組股骨頭組織中OPG、VEGF164 和VEGFR2 的mRNA 表達均升高,RANKL和RANK的mRNA表達均降低(P<0.05)。與C 組和D 組相比,E 組股骨頭組織中OPG、VEGF164和VEGFR2 的mRNA 表達均升高,RANKL 和RANK 的mRNA表達均降低(P<0.05),見表3。

        表3 各組家兔股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL和RANK mRNA表達

        3 討論

        本研究首次將髓芯減壓、膠原基骨修復材料和VEGF 這三種材料結合起來治療ONFH,結果顯示,髓芯減壓聯(lián)合自體松質骨、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料和VEGF 這三種治療方法均有效提高了股骨頭骨密度,HE 染色結果表明上述治療方法均可促進骨小梁形成、血管生成和ONFH 區(qū)域的修復,并使空骨陷窩比率降低。通過檢測股骨頭生物力學參數(shù)變化可知,這三種治療方法均提高了股骨頭的力學強度,從而避免了股骨頭塌陷骨折的發(fā)生。分析其原因,髓芯減壓可降低骨內壓、改善血供;膠原基骨修復材料孔隙率較高,孔徑尺度多樣,為血液流動提供了良好的基礎;VEGF 能促進血管內皮細胞增殖和血管生成,促進形成新骨,這三種材料均可促進ONFH區(qū)域的修復。

        本研究還檢測了各組家兔的股骨頭組織中OPG、VEGF164、VEGFR2、RANKL 和RANK mRNA 的表達。OPG、RANKL 和RANK 是重要的骨形成調控因子。OPG作為RANKL的誘騙受體,與RANK結合并抑制破骨細胞生成[12-13]。RANKL 與OPG 有拮抗作用,其通過與RANK 結合促進破骨細胞的生成和分化,RANKL/OPG比率決定了骨生成或骨吸收[14]。血管生成障礙可抑制骨形成,引起骨骼壞死[15]。VEGF/VEGFR 信號通路是最重要的血管生成調節(jié)通路,在調節(jié)骨形成和骨修復中發(fā)揮重要作用,并刺激骨損傷部位血管再生[16-17]。脊椎動物VEGF 家族中主要以VEGFA 為主,VEGFR2 是VEGFR 家族中的最主要受體[18-19]。本研究表明,髓芯減壓聯(lián)合自體松質骨、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料、髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料和VEGF 這三種治療方法均升高了股骨頭組織中OPG、VEGF164 和VEGFR2 的轉錄水平,降低了RANKL 和RANK 的轉錄水平,并且三種材料復合的效果最佳。說明三種材料復合療法可有效調控骨形成基因和血管生成基因的表達。

        本研究結果證實髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨材料和VEGF 的治療效果優(yōu)于髓芯減壓聯(lián)合自體松質骨和髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料。分析其原因可能包括以下方面:①髓芯減壓可降低骨內壓,改善血供,促進壞死股骨頭的修復[4]。②膠原基骨修復材料中的膠原為細胞生長提供了適宜的環(huán)境,并且該材料的孔隙率較高,孔徑尺度豐富,有效保證了血液流動。③VEGF 能特異性促進血管內皮細胞增殖和血管生成,促進新骨形成[20-22]。該復合療法充分發(fā)揮了各材料的優(yōu)勢,從而最大限度地促進了ONFH區(qū)域的修復。

        綜上所述,髓芯減壓聯(lián)合膠原基骨修復材料和VEGF 復合療法可有效提高ONFH 家兔股骨頭的骨密度和強度,促進損傷區(qū)域的骨形成和血管生成,從而促進股骨頭的修復,該療法可能是治療ONFH 的新型高效療法,具有較高的研究價值。

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