梁光萍 高玲 陳曉蘭 張寧 羅樂 李嘉

腹水是肝硬化由代償期進(jìn)入失代償期的典型并發(fā)癥之一,一旦腹水形成,患者第1年和第5年的病死率分別約為15%和44%～85%[1]。腹水發(fā)病機(jī)制尤為復(fù)雜,與門脈高壓、血漿膠體滲透壓降低、淋巴液增多、醛固酮系統(tǒng)活性增強(qiáng)等有關(guān)[2],其中門脈高壓被認(rèn)為是導(dǎo)致肝硬化腹水形成的始動(dòng)和關(guān)鍵因素。而在門脈高壓中,活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是門脈高壓形成的中心環(huán)節(jié)[3-4],故誘導(dǎo)活化的HSC發(fā)生凋亡,是治療肝硬化腹水的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

馬蘭草為菊科植物,民間道地藥材,有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝等作用,其味辛性寒、涼,有清熱解毒、理氣消腫、涼血、利濕功效。課題組前期通過臨床研究初步發(fā)現(xiàn)采用口服健脾活血祛濕方聯(lián)合馬蘭草臍灸,能改善肝硬化腹水患者肝功能指標(biāo)和腹水量,緩解腹脹等[5]?；A(chǔ)研究方面,采用馬蘭草臍灸治療肝纖維化模型大鼠能有效改善肝纖維化程度[6-7],且在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了馬蘭提取物對(duì)活化的HSC-T6有促凋亡的功效[8]。鑒于前期研究成果,本研究將馬蘭草制備成凝膠貼劑,以貼敷臍療法為干預(yù)方法,通過觀察肝硬化腹水大鼠的一般情況、腹水量改變、肝組織病理變化、及相關(guān)B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2關(guān)聯(lián)X(Bcl-2 associated X,Bax)因子的表達(dá)變化,探索治療肝硬化腹水大鼠可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

60只SPF級(jí)健康Wistar雄性大鼠,6周齡,體質(zhì)量180～200g,購自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(湘)2019-0014。自由飲水飲食,12小時(shí)/12小時(shí)的光暗循環(huán),環(huán)境溫度(22±3)℃,相對(duì)濕度(50±10)%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

馬蘭草采摘于貴州畢節(jié),經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥實(shí)驗(yàn)室田源紅教授鑒定為菊科植物馬蘭[Kalimerisindica(L.)Sch-Bip]的帶根全草。稱取馬蘭草粉末200 g(過3號(hào)篩),加10倍量70%乙醇回流取3次,濃縮液濃度為0.1 g/mL(以生藥計(jì)),洗脫劑采用95%乙醇,1 BV/h的速度洗脫,得到純化物備用。以NP-700(0.009 7)∶甘油(0.548 5)∶純水(0.347 5)∶Al(OH)3(0.011 0)∶酒石酸(0.003 5)∶薄荷腦(0.013 2)的配比,制備基質(zhì),加入13.37 g的馬蘭純化物進(jìn)行配置,充分?jǐn)嚢杈鶆?靜置30分鐘以備用[9]。

呋塞米(20 mg/片,南通制藥總廠),螺內(nèi)酯(20 mg/片,杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.3 主要試劑

四氯化碳(貨號(hào)C10711535,上海麥克林);橄欖油(貨號(hào)QS310002012787,上海嘉里食品工業(yè)有限公司);水合氯醛(貨號(hào)A600288-0250)、多聚甲醛(貨號(hào)A500684)購自上海生工;白蛋白檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)A020-1,北京雷根);PBS(貨號(hào)210220,莫納生物科技有限公司);伊紅染色液(貨號(hào)DH0055)、蘇木素染色液(貨號(hào)DH0001)購自雷根生物;山羊血清(貨號(hào)C0265)、DAPI染液(貨號(hào)C1005)、抗熒光淬滅劑(貨號(hào)P0126)、TritonX-100(貨號(hào)ST795)、Tunel染色試劑盒(C1089)購自碧云天;Bax一抗(貨號(hào)A19684,Abclonal);Bcl-2一抗(貨號(hào)ab182858,美國Abcam)。

1.4 主要儀器

BSA224S型電子分析天平(萬分之一)(瑞士Precisa12A公司);RM2235型切片機(jī)、HI1220型烤片機(jī)、HI1210型展片機(jī)(德國Leica);Thermo型微量紫外-可見光分光光度計(jì)(美國NanoDrop One/One C);4402型膠體滲透壓儀(美國WESCOR);DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);SP0009-R型外科手術(shù)器械包(瑞沃德);HB-RO/60型超純水儀(美國Millipore);LMQ C-50EP型高壓蒸汽消毒滅菌鍋(浙江紹興醫(yī)療器械總廠);TCS-SP8型激光共聚焦成像系統(tǒng)(德國Leica);CKK53型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.5 肝硬化腹水大鼠模型建立

將60只健康SPF雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組(10只)和造模組(50只),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,參照文獻(xiàn)方法[10]空白組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),造模組給予腹腔注射CCl4-橄欖油混合液(4∶6)進(jìn)行造模,飲用水為10%的醫(yī)用酒精水溶液。根據(jù)體質(zhì)量,除第1天注射劑量按3.0 mL/kg計(jì)算,以后每天的劑量為2.0 mL/kg,隔天1次,持續(xù)6周。隨機(jī)抓10只抽取腹水,根據(jù)成模標(biāo)準(zhǔn)[11-12]判斷是否成功復(fù)制肝硬化腹水大鼠模型。

1.6 分組及給藥

將40只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、基質(zhì)組、馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內(nèi)酯組,每組10只。空白組、模型組常規(guī)飲食飲水,脫毛抓取,將大鼠放置在大鼠固定器上,固定時(shí)間同基質(zhì)組和馬蘭草凝膠貼劑組的時(shí)間?；|(zhì)組給予無藥物的基質(zhì)臍貼,兩天一次,每次1.5小時(shí),干預(yù)持續(xù)8周。臍貼貼于大鼠神闕穴,位于大鼠胸腹正中線,胸骨柄上緣至外生殖器連線的上3/4及下1/4交界處[13]。馬蘭草凝膠貼劑組給予馬蘭草凝膠貼敷于臍,兩天一次,每次1.5小時(shí),干預(yù)持續(xù)8周。呋塞米+螺內(nèi)酯組以1∶1混合濃度為0.082 5 mg/mL,灌胃劑量10 mL/kg,兩天一次,干預(yù)持續(xù)8周。

1.7 取材

大鼠末次給藥后,禁食12小時(shí),不禁水,腹腔注射10%水合氯醛,以麻醉大鼠。將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,延腹中線用手術(shù)刀切開,進(jìn)入腹腔,分離腹主動(dòng)脈取血5 mL,靜置2小時(shí)后,4℃ 3 000 r/min離心20分鐘,分離血清,-20℃凍存待檢,保存?zhèn)溆?。每組隨機(jī)抽取三只大鼠肝臟,在肝右葉離邊緣1 cm處,剪取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織塊,液氮保存。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 給藥期間觀察各組大鼠活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、皮毛潤澤度、飲食及大便等一般狀態(tài)改變。

1.8.2 腹水測(cè)量 給藥結(jié)束后取材時(shí),將大鼠采用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,剖腹,采用無菌干棉球沾取腹水稱量。

1.8.3 大鼠測(cè)量白蛋白、膠體滲透壓 剝離出腹主動(dòng)脈,采集血液約5 mL,靜置1小時(shí)后,4 000 r/min離心10分鐘取血清,按照檢測(cè)試劑盒操作說明書檢測(cè)血清白蛋白、膠體滲透壓水平。

1.8.4 大鼠肝組織病理變化 剪取肝組織,浸泡在4%多聚甲醛中,常規(guī)脫蠟、包埋,做石蠟病理切片,用于蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,鏡下觀察病理切片變化,拍照。

1.8.5 Tunel-α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)雙標(biāo)記法檢測(cè)活化HSC凋亡情況 切取肝組織5 μm置于防脫玻片上,常規(guī)石蠟切片脫蠟、復(fù)水,雙蒸水清洗2分鐘×3次。滴加一抗Anti SMA,并放置在濕盒中4℃孵育下過夜。磷酸緩沖鹽溶液洗滌3分鐘×3次。然后用不含DNase的蛋白酶K,滴加20 μg/mL,放置于37℃烤箱,留置30分鐘。磷酸緩沖鹽溶液洗滴2分鐘×3次。滴加Tunel檢測(cè)液50 μL,蓋上蓋玻片。放置于37℃烤箱,留置30分鐘,室溫避光下孵育60分鐘。磷酸緩沖鹽溶液洗滴2分鐘×3次。DAPI復(fù)染,抗熒光淬滅劑封片。放置在顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況,拍照、采集圖像。

1.8.6 免疫熒光法檢測(cè)Bax和Bcl-2 0.5% TritonX-100,磷酸緩沖鹽溶液清洗切片3分鐘×3次。封閉切片滴入正常山羊血清,室溫60分鐘,切片加一抗(1∶200,PBS稀釋),置于4攝氏度下過夜。磷酸緩沖鹽溶液重復(fù)洗滌3分鐘×3次,滴加熒光二抗488(1∶300,PBS稀釋)37攝氏度60分鐘。磷酸緩沖鹽溶液浸洗3分鐘×3次,滴加一抗(1∶200,PBS稀釋),37攝氏度60分鐘,滴加熒光二抗488(1∶300,PBS稀釋),37攝氏度60分鐘,磷酸緩沖鹽溶液浸洗3次各3分鐘。DAPI核染,放置室溫避光15分鐘(暗室內(nèi)進(jìn)行),再用磷酸緩沖鹽溶液重復(fù)沖洗4次各5分鐘,熒光顯微鏡下觀察各組熒光強(qiáng)度、拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

空白組大鼠活動(dòng)度大,運(yùn)動(dòng)靈活,精神狀態(tài)佳,皮毛光澤明潤,食欲正常,糞便成形;模型組大鼠活動(dòng)緩慢,精神萎靡,皮毛澤松散,飲食不振,便溏。各治療組用藥后上述表現(xiàn)逐漸好轉(zhuǎn),尤其馬蘭草凝膠貼劑組改善明顯。

2.2 大鼠腹水量比較

與空白組比,模型組大鼠腹水量明顯增加(P<0.01);與模型組比,基質(zhì)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內(nèi)酯組的腹水量均呈明顯降低趨勢(shì)(P<0.01),尤以馬蘭草凝膠貼劑組的腹水量降低最為明顯;與基質(zhì)組比,馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內(nèi)酯組的腹水量均降低(P<0.01),尤其馬蘭草凝膠貼劑組的腹水量降低最為顯著。見表1。

表1 各組肝硬化腹水模型大鼠腹水量比較

2.3 大鼠血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平比較

與空白組比,模型組血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平均明顯降低(P<0.01);與模型組相比,基質(zhì)組血清白蛋白水平下降(P<0.05),血漿膠體滲透壓水平降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內(nèi)酯組血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平均明顯升高(P<0.01),尤以馬蘭草凝膠貼劑組升高水平最為明顯;與基質(zhì)組比,馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內(nèi)酯組血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平均明顯升高(P<0.01),尤其蘭草凝膠貼劑組升高最為顯著。見表2。

表2 各組肝硬化腹水模型大鼠血清白蛋白、血漿膠體滲透壓比較

2.4 大鼠肝組織病理學(xué)觀察

空白組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰,細(xì)胞形態(tài)正常,肝血竇未見擴(kuò)張。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,假小葉形成,肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死,炎性細(xì)胞浸潤,纖維增生明顯。基質(zhì)組可見少量纖維增生,門管區(qū)少量炎性細(xì)胞浸潤。馬蘭草凝膠貼劑組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常,細(xì)胞大小均勻,門管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤顯著減輕。呋塞米+螺內(nèi)酯組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)恢復(fù)近正常,假小葉未見形成。見圖1。

注A 空白組;B 模型組;C 基質(zhì)組;D 馬蘭草凝膠貼劑組;E 呋塞米+螺內(nèi)酯組。圖1 各組肝硬化腹水模型大鼠肝組織病理切片(HE染色,×200)

2.5 大鼠肝組織活化HSC凋亡情況

圖中綠色熒光代表活化HSC表達(dá)的α-SMA陽性細(xì)胞,紅色熒光代表凋亡的Tunel陽性細(xì)胞,Merge圖中玫紅色代表活化的HSC凋亡。結(jié)果顯示,與空白組比,模型組有少數(shù)不明顯的Tunel陽性細(xì)胞,有許多明顯的α-SMA陽性細(xì)胞;與模型組比,基質(zhì)組的α-SMA陽性細(xì)胞明顯增多,熒光明顯增強(qiáng),Tunel陽性細(xì)胞明顯增多,馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內(nèi)酯組的α-SMA陽性細(xì)胞明顯減少,Tunel陽性細(xì)胞明顯增多,熒光明顯增強(qiáng)。與基質(zhì)組比,馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內(nèi)酯組的α-SMA陽性細(xì)胞明顯減少,熒光減弱,Tunel陽性細(xì)胞增多;與馬蘭草凝膠貼劑組比,呋塞米+螺內(nèi)酯組中α-SMA陽性細(xì)胞明顯增多,熒光明顯增強(qiáng),Tunel陽性細(xì)胞增多,表明馬蘭草凝膠貼劑更能抑制細(xì)胞活化,促進(jìn)活化HSCs凋亡。見圖2。

圖2 各組肝硬化腹水模型大鼠肝組織活化HSC凋亡情況(Tunel-α-SMA法,×200)

2.6 大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

與空白組比較,模型組Bcl-2、Bax表達(dá)量顯著升高,熒光顯著增強(qiáng);與模型組比較,基質(zhì)組Bcl-2、Bax表達(dá)量均降低,熒光減弱,馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內(nèi)酯組的Bcl-2表達(dá)量降低,熒光減弱,Bax表達(dá)量明顯升高;與基質(zhì)組比,馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內(nèi)酯組Bcl-2表達(dá)量降低,熒光減弱,Bax表達(dá)量明顯升高,其中馬蘭草凝膠貼劑組Bax表達(dá)量升高最為顯著。見圖3。

3 討論

肝硬化是受一種或者多種因素(病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎)的反復(fù)影響而發(fā)展而來的慢性、進(jìn)行性肝病,預(yù)后不良,并發(fā)癥多,其中腹水是肝硬化晚期進(jìn)入失代償期的典型并發(fā)癥之一。目前認(rèn)為門脈高壓是肝硬化腹水發(fā)病機(jī)制的始動(dòng)因素[14],活化的HSCs在門脈高壓中占據(jù)主導(dǎo)作用[15],故誘導(dǎo)活化的HSCs凋亡是治療肝硬化腹水的有效策略。HSCs位于Disse腔中,呈梭形、多邊形,形態(tài)不規(guī)則。肝臟未受炎癥物質(zhì)及外界刺激時(shí),HSCs處于靜止的狀態(tài),不表達(dá)α-SMA,當(dāng)肝臟被刺激時(shí),靜態(tài)的HSCs被激活,高表達(dá)α-SMA,使HSCs收縮力增強(qiáng),肝內(nèi)壓力變大,靜脈壓力增高[16]。本研究結(jié)果顯示,馬蘭草凝膠貼劑組的α-SMA陽性細(xì)胞結(jié)果表達(dá)明顯減少,熒光減弱,Tunel陽性細(xì)胞增多,提示馬蘭草凝膠貼干預(yù)能有效地引起活化的HSCs產(chǎn)生凋亡,對(duì)肝硬腹水大鼠治療有效。

Bcl-2家族由促凋亡(或細(xì)胞死亡)和抗凋亡(或細(xì)胞存活)基因組成,正是這些基因譜系之間的表達(dá)平衡決定了細(xì)胞的死亡或存活,Bcl-2家族分子分為Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Bax(促凋亡蛋白)[17-18]。促凋亡、抗凋亡與Bax/Bcl-2比值密切聯(lián)系,Bax蛋白表達(dá)量升高,Bcl-2蛋白表達(dá)量降低,比值升高,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,反之起抑制細(xì)胞凋亡作用。有研究表明[19],在新型孕烯醇酮衍生物通過Bcl-2家族基因調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的體外研究中發(fā)現(xiàn),通過提高Bax/Bcl-2比值,能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)馬蘭草凝膠貼劑組能顯著升高Bax表達(dá),降低Bcl-2表達(dá),表明馬蘭草凝膠貼能有效促進(jìn)活化HSCs產(chǎn)生凋亡,改善肝硬化腹水。

肝硬化腹水屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”“鼓脹”“脅痛”“黃疸”的范疇,主要病因有飲食不節(jié)、七情、過度勞欲等,病機(jī)與肝、脾、腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān),表現(xiàn)為肝失疏泄,脾失健運(yùn),腎失開闔,致氣、血、瘀、水積于腹中[20]。本病的治療應(yīng)采用疏肝理氣、健脾助運(yùn),溫腎陽以開闔的治療原則,達(dá)行氣活血、散瘀消腫的功效。

中醫(yī)貼敷臍療法發(fā)揮藥、穴位、經(jīng)絡(luò)聯(lián)合作用,可起到疏通全身氣血、溫通經(jīng)脈、活絡(luò)散瘀的功效。貼敷臍療法又被稱作“臍療法”,將藥物于貼敷神闕穴處,神闕穴與五臟、六腑、全身經(jīng)絡(luò)密切聯(lián)系,主司百脈[21]。且在胚胎發(fā)育過程當(dāng)中,臍作為腹壁的最后的閉合之處,該處無脂肪組織,角質(zhì)層菲薄,是多條經(jīng)脈循行之地,有眾多靜脈網(wǎng)和動(dòng)脈分支經(jīng)過,因此使其具備吸收力強(qiáng)、迅速,生物利用度高的特點(diǎn),藥物通過臍快速疏布至全身[22]。

患有腹水的患者免疫力都大幅度減低,從細(xì)胞水平上進(jìn)行剖析,通過刺激神闕穴,能起到激活機(jī)體免疫系統(tǒng)、提高免疫功能作用[23]。馬蘭草為菊科馬蘭的全草,是一種藥食同源的植物,具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值,化學(xué)成分主要包括萜、有機(jī)酸、糖苷、酚類等化合物,藥理效應(yīng)有保肝、抗氧化、抗腫瘤、抗炎[24]。有研究顯示[25],馬蘭草治療肝病療效確切,具有一定的預(yù)防和治療作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)馬蘭草臍灸能改善肝硬化腹水大鼠的一般狀態(tài),消退腹水。本研究結(jié)果顯示,馬蘭草凝膠貼劑可改善大鼠一般狀態(tài),顯著降低大鼠腹水量,升高血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平,病理檢測(cè)見微量炎性細(xì)胞、細(xì)胞變性減少、細(xì)胞大小均勻,提示馬蘭草凝膠貼劑能有效促進(jìn)腹水的消退,緩解腹脹,增加肝臟的供血量,修復(fù)肝組織病理形態(tài),減輕肝細(xì)胞損傷。

綜上所述,馬蘭草凝膠貼劑能有效治療肝硬化腹水大鼠,其作用可能機(jī)制與修復(fù)肝組織病理形態(tài)和促進(jìn)活化的HSCs凋亡有關(guān)。