陳立喜，陳元良，卓澤銘，王和杰

慢性骨髓炎是細(xì)菌感染引起的伴有骨質(zhì)破壞的慢性炎癥過(guò)程，好發(fā)于開(kāi)放性骨折或創(chuàng)傷后多次手術(shù)人群，骨折部位不穩(wěn)定、置入固定物、軟組織損傷、清創(chuàng)不徹底等因素可引起感染后局部組織潰爛、骨壞死，導(dǎo)致病情反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈［1-2］。手術(shù)徹底清創(chuàng)后抗菌藥物灌注治療是目前臨床上治療慢性骨髓炎的主要方式，但抗菌藥物長(zhǎng)期使用會(huì)增加致病菌耐藥性，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染引起的慢性骨髓炎發(fā)病率呈升高趨勢(shì)［3］。利奈唑胺屬于唑烷酮類抗菌藥物，可通過(guò)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成來(lái)滅殺甲氧西林耐藥革蘭陽(yáng)性球菌［4］。慢性骨髓炎引起的骨骼肌纖維化、瘢痕形成是導(dǎo)致患者肢體功能障礙的主要因素，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1 是組織纖維化過(guò)程中的重要分子標(biāo)志物，已被證實(shí)在創(chuàng)傷性骨髓炎大鼠骨組織中表達(dá)明顯升高［5］。TGF-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic protein，BMP）是哺乳動(dòng)物骨形成生理過(guò)程中的重要信號(hào)通路之一，TGF-β1/BMP-2 可協(xié)同促進(jìn)骨分化過(guò)程［6］。本研究通過(guò)MRSA 構(gòu)建慢性骨髓炎大鼠模型，給予利奈唑胺干預(yù)，初步探究利奈唑胺的作用效果是否與TGF-β/BMP 信號(hào)通路變化有關(guān)，旨在為慢性骨髓炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級(jí)健康雄性Wistar 大鼠45 只，6～8 周齡，體質(zhì)量290～350 g，購(gòu)自廣東維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2022-0063］，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，飼養(yǎng)室溫度24～25 ℃，相對(duì)濕度12%，光/暗循環(huán)為12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作嚴(yán)格遵守中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T35892-2018《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》。MRSA 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；利奈唑胺葡萄糖注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20150223）購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司；TGF-β1、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔源抗TGF-β1、激活素受體樣激酶1（activin receptor-like kinase 1，ALK-1）、BMP-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔源抗Smad1/5、p-Smad1/5抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；BX53型顯微鏡購(gòu)自日本日立公司；Western blot 電泳儀、ChemiDoc MP 凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；Multuskan Go 1510 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 動(dòng)物分組、建模及干預(yù)

以隨機(jī)數(shù)字表法將45只Wistar大鼠分為假手術(shù)組、模型組、利奈唑胺組，各15只。參考文獻(xiàn)［7］方法造模：大鼠稱質(zhì)量后以氯胺酮（10 mg/kg）腹部皮下注射麻醉，8%硫化鈉（Na2S）擦拭膝關(guān)節(jié)及小腿皮膚脫毛，完成后生理鹽水反復(fù)沖洗，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，于膝關(guān)節(jié)沿脛骨內(nèi)側(cè)做1.5 cm 切口，依次剝開(kāi)骨膜后暴露脛骨上端，于膝關(guān)節(jié)下10 mm處，用2.5 mm 鉆頭鉆入骨髓腔，挖出部分骨髓后形成空腔；模型組、利奈唑胺組大鼠于空腔內(nèi)接種10 μL 含1.0×108CFU/mL 的MRSA懸液，接種后，將長(zhǎng)度為5 mm、厚度為1 mm的克氏針插入脛骨腔，使用牙科石膏填充鉆孔，縫合皮膚并應(yīng)用聚維酮碘溶液消毒。造模后7 d，利奈唑胺組大鼠參考文獻(xiàn)［8］中利奈唑胺的使用劑量腹腔注射54 mg/kg，假手術(shù)組及模型組給予等體積葡萄糖注射液，連續(xù)14 d。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 傷口愈合及Rissing、Norden評(píng)分觀察

（1）末次給藥結(jié)束后7 d，根據(jù)傷口愈合標(biāo)準(zhǔn)［9］進(jìn)行觀察，記錄各組大鼠甲、乙、丙級(jí)愈合情況。甲級(jí)愈合：傷口愈合良好；乙級(jí)愈合：愈合處有紅腫、血腫、積液等炎癥反應(yīng)，但未化膿；丙級(jí)愈合：傷口處有化膿。（2）末次給藥結(jié)束后7 d，對(duì)模型組、利奈唑胺組大鼠右后肢正、側(cè)位拍攝X線片，參考改良X 線Norden 骨髓炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［10］進(jìn)行半定量評(píng)估：①死骨形成。有死骨記3 分，疑似死骨形成記1.5 分，無(wú)死骨記0 分。②骨質(zhì)破壞。有記2分，疑似記1分，無(wú)記0分。③骨質(zhì)增生。有記1 分，疑似記0.5 分，無(wú)記0 分。④軟組織炎性包塊影。有記1分，疑似記0.5分，無(wú)記0分。最高分7分，分?jǐn)?shù)越高表示骨髓炎程度越嚴(yán)重。（3）末次給藥結(jié)束后7 d，頸椎脫臼法處死模型組、利奈唑胺組大鼠，稱體質(zhì)量后，剝離皮膚和筋膜后暴露脛骨組織，肉眼觀察后進(jìn)行Rissing 評(píng)分［9］：嚴(yán)重骨質(zhì)吸收、膿腫，記4分；紅斑并脛骨骨干增粗、竇道形成或膿液滲出，記2 分；少量紅斑，記1 分；無(wú)膿腫、紅斑、死骨、水腫和新骨形成，記0分；評(píng)分由同一人完成。收集骨髓組織用于細(xì)菌負(fù)荷測(cè)定，并取病灶組織周圍骨骼肌組織凍存后-20 ℃保存，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)。將脛骨組織分成兩部分，一部分4%中性甲醛固定脫鈣后行HE 染色病理觀察，另一部分液氮凍存后-80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡檢測(cè)。

1.3.2 細(xì)菌負(fù)荷測(cè)定

將骨髓組織勻漿培養(yǎng)于巧克力培養(yǎng)基中，放置5%CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌及菌落情況進(jìn)行觀察。

1.3.3 HE染色觀察脛骨組織病理改變

取1.3.1中固定脫鈣后的脛骨組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，每組選取3張4μm石蠟切片，脫蠟，蘇木精、伊紅染色后脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 骨骼肌炎性因子水平檢測(cè)

將凍存的病灶組織周圍的骨骼肌組織進(jìn)行勻漿后，采用ELISA法檢測(cè)TGF-β1、IL-1β、IL-6等水平，所有操作過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)TGF-β/BMP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取50 mg 凍存的脛骨組織于含液氮的研缽中，磨成粉末后加入離心管中，加入蛋白提取試劑，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度一致后，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過(guò)的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，密封2 h，加入兔抗鼠TGF- β1、ALK-1、Smad1/5、p-Smad1/5、BMP-2、GAPDH 一抗（1∶500）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗40 min，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育1 h，TBST 漂洗40 min，ECL 發(fā)光液將PVDF膜顯色，曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件和SigmaStat 3.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法；2組等級(jí)資料比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利奈唑胺對(duì)MRSA 致慢性骨髓炎大鼠創(chuàng)口愈合及Rissing、Norden評(píng)分、細(xì)菌負(fù)荷的影響

末次給藥結(jié)束后7 d觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠均為甲級(jí)愈合，模型組大鼠乙級(jí)愈合3只、丙級(jí)愈合12只，利奈唑胺組大鼠乙級(jí)愈合9只、丙級(jí)愈合6只，各組大鼠創(chuàng)口愈合情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=35.111，P＜0.01）。與模型組比較，利奈唑胺組大鼠Rissing、Norden 評(píng)分、細(xì)菌負(fù)荷均降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of Rissing,Norden scores and bacterial load between the model group and the linezolid group表1 模型組與利奈唑胺組大鼠Rissing、Norden評(píng)分及細(xì)菌負(fù)荷比較（n=15，±s）

Tab.1 Comparison of Rissing,Norden scores and bacterial load between the model group and the linezolid group表1 模型組與利奈唑胺組大鼠Rissing、Norden評(píng)分及細(xì)菌負(fù)荷比較（n=15，±s）

＊＊P＜0.01。

組別模型組利奈唑胺組t Rissing評(píng)分/分2.85±0.32 1.62±0.38 9.589＊＊Norden評(píng)分/分2.75±0.43 1.35±0.31 10.229＊＊細(xì)菌負(fù)荷/（CFU/mL）2.13±0.42 0.51±0.04 14.871＊＊

2.2 利奈唑胺對(duì)MRSA 致慢性骨髓炎大鼠脛骨病理學(xué)的影響

假手術(shù)組大鼠脛骨無(wú)炎癥反應(yīng)；模型組大鼠局部骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，明顯髓腔內(nèi)及骨膜下膿腫，明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)及局部纖維化；利奈唑胺組大鼠較模型組骨質(zhì)破壞較輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化明顯減輕。見(jiàn)圖1。

Fig.1 Pathological changes of tibia tissue in each group（HE staining,×100）圖1 各組大鼠脛骨組織病理變化（HE染色，×100）

2.3 利奈唑胺對(duì)MRSA 致慢性骨髓炎大鼠骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和利奈唑胺組骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，利奈唑胺組大鼠骨骼肌組織中TGF-β1、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison on levels of TGF-β1,IL-1β and IL-6 in skeletal muscle tissue between different groups表2 各組大鼠骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平比較（n=15，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison on levels of TGF-β1,IL-1β and IL-6 in skeletal muscle tissue between different groups表2 各組大鼠骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平比較（n=15，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05，表3同。

組別假手術(shù)組模型組利奈唑胺組F TGF-β1 21.24±5.17 185.18±16.51a 75.35±23.48ab 369.144＊＊IL-1β 29.51±6.12 115.32±25.73a 58.25±14.38ab 94.726＊＊IL-6 11.35±2.42 69.51±17.64a 28.61±7.25ab 108.634＊＊

2.4 利奈唑胺對(duì)MRSA 致慢性骨髓炎大鼠脛骨組織中TGF-β/BMP通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和利奈唑胺組脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5 蛋白表達(dá)升高，BMP-2 蛋白降低（P＜0.05）；與模型組比較，利奈唑胺組脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5 蛋白降低，BMP-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖2。

Fig.2 Expressions of TGF-β/BMP pathway-related proteins detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測(cè)TGF-β/BMP通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Tab.3 Comparison on expression levels of TGF-β1,ALK-1,p-Smad1/5 and BMP-2 in tibia tissue between different groups表3 各組大鼠脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5、BMP-2蛋白表達(dá)水平比較 （n=15，±s）

Tab.3 Comparison on expression levels of TGF-β1,ALK-1,p-Smad1/5 and BMP-2 in tibia tissue between different groups表3 各組大鼠脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5、BMP-2蛋白表達(dá)水平比較 （n=15，±s）

組別假手術(shù)組模型組利奈唑胺組F TGF-β1 0.42±0.07 1.18±0.25a 0.78±0.14ab 74.759＊＊ALK-1 0.31±0.05 1.32±0.27a 0.65±0.18ab 110.246＊＊p-Smad1/5 0.35±0.06 0.95±0.24a 0.67±0.17ab 45.017＊＊BMP-2 0.53±0.09 0.35±0.06a 0.42±0.07ab 22.319＊＊

3 討論

細(xì)菌感染是慢性骨髓炎的基本病因，骨細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)可作為MRSA侵入機(jī)體后的黏附載體，MRSA持續(xù)增殖后會(huì)釋放大量的內(nèi)毒素，影響骨吸收、骨形成動(dòng)態(tài)平衡；同時(shí)，細(xì)菌生物膜可以阻擋抗菌藥物滲入，降低細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，使抗菌藥物的抗菌效果減弱，抗菌藥物廣泛使用又會(huì)增加細(xì)菌的耐藥概率，因而耐藥菌感染所致慢性脊髓炎的臨床治療難度較大［11-12］。利奈唑胺可與細(xì)菌50S 亞基的23S 核糖體RNA 上的位點(diǎn)結(jié)合，阻止功能性70S 始動(dòng)復(fù)合物的形成，抑制細(xì)菌細(xì)胞蛋白合成，且與其他抗菌藥物沒(méi)有交叉耐藥現(xiàn)象，目前利奈唑胺在多重耐藥革蘭陽(yáng)性菌所致感染疾病治療中取得明顯效果［13］。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建MRSA感染所致慢性骨髓炎模型來(lái)探究利奈唑胺對(duì)慢性骨髓炎潛在作用機(jī)制。

目前用于慢性骨髓炎研究的動(dòng)物模型類型較多，Wistar 大鼠因其脛骨小、骨質(zhì)易鉆透、機(jī)體耐受力強(qiáng)以及成本低等優(yōu)勢(shì)［14］，常用作慢性骨髓炎模型制備的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。慢性骨髓炎大鼠模型制備是否成功與細(xì)菌接種劑量關(guān)系密切，細(xì)菌接種劑量過(guò)大可致死，接種劑量過(guò)小無(wú)法達(dá)到模型預(yù)期效果，10μL 1×108CFU/mL 是MRSA 目前比較適宜的造模劑量［15］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠創(chuàng)口愈合較差，且創(chuàng)口有流膿現(xiàn)象，而利奈唑胺組大鼠創(chuàng)口愈合情況較模型組得到明顯改善，且Rissing評(píng)分、Norden評(píng)分和細(xì)菌負(fù)荷較模型組明顯降低，說(shuō)明利奈唑胺干預(yù)可促進(jìn)MRSA感染所致慢性骨髓炎創(chuàng)口愈合，改善病灶組織內(nèi)環(huán)境，可能與降低細(xì)菌負(fù)荷有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的脛骨組織呈現(xiàn)出局部骨質(zhì)破壞現(xiàn)象，且髓腔內(nèi)和骨膜下有膿腫產(chǎn)生，還伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和局部纖維化，而給予利奈唑胺干預(yù)可使慢性骨髓炎大鼠上述病理癥狀得到明顯緩解，說(shuō)明慢性骨髓炎大鼠處于感染性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，給予利奈唑胺干預(yù)可以改善這種炎癥狀態(tài)。細(xì)菌感染、創(chuàng)傷愈合過(guò)程中均伴有炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)誘導(dǎo)多種生長(zhǎng)因子過(guò)度表達(dá)［16］，TGF-β就是其中一員。TGF-β作為多肽信號(hào)分子，可在創(chuàng)傷愈合及瘢痕修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［17］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠病灶組織周圍的骨骼肌組織中TGF-β1、IL-1β、IL-6 水平較假手術(shù)組升高，而利奈唑胺干預(yù)可降低TGF-β1、IL-1β、IL-6 水平，這提示利奈唑胺干預(yù)可通過(guò)抑菌作用減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)慢性骨髓炎恢復(fù)。

TGF-β超家族可通過(guò)結(jié)合特定的Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸或蘇氨酸激酶受體，將細(xì)胞內(nèi)Smad轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核來(lái)發(fā)揮其相應(yīng)作用［18］。ALK-1是TGF-β的Ⅰ型受體，ALK-1 激活可招募Smad1/5 并使Smad1/5磷酸化，磷酸化的Smad1/5被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核后編碼下游效應(yīng)蛋白合成［19-20］。BMP 是TGF-β 超家族成員之一，具有成骨因子作用，可通過(guò)刺激間充質(zhì)骨祖細(xì)胞分化為成熟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)骨、軟骨及骨相關(guān)結(jié)締組織形成［21］。BMP-2 是促進(jìn)骨形成及誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化重要細(xì)胞外信號(hào)分子［22］。本研究通過(guò)分析慢性骨髓炎大鼠脛骨組織中TGF-β/BMP 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，模型組大鼠骨組織TGFβ1、ALK-1 及p-Smad1/5 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，而B(niǎo)MP-2 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，提示過(guò)度活化TGF-β信號(hào)通路可能抑制BMP-2表達(dá)，從而抑制骨修復(fù)，而利奈唑胺干預(yù)后可以抑制TGFβ通路，解除過(guò)度活化TGF-β信號(hào)通路對(duì)BMP-2的抑制效用，促進(jìn)骨修復(fù)。

綜上所述，利奈唑胺可通過(guò)抑菌作用減輕慢性骨髓炎病灶處的過(guò)度炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TGF-β 通路解除對(duì)BMP-2 介導(dǎo)的骨形成抑制作用，從而促進(jìn)骨修復(fù)。本研究初步探討了利奈唑胺對(duì)MRSA 感染慢性骨髓炎的可能作用機(jī)制，但其防治作用是否與其他信號(hào)通路有關(guān)尚需進(jìn)一步探究。