曲俊儒 李軍喬 田甜 王鑫慈 呂博文

摘要 采用大孔吸附樹脂法和有機溶劑萃取法對蕨麻塊根中單寧成分進(jìn)行分離純化，并考察不同純化方法下得到單寧樣品對DPPH·和·OH的清除能力。結(jié)果表明，大孔樹脂純化蕨麻單寧的最佳工藝條件：選用X-5型大孔樹脂，上樣流速為1.0 mL/min，上樣液濃度為1.01 mg/mL，洗脫液為60%乙醇溶液，洗脫流速為1.5 mL/min。乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯萃余物、大孔樹脂純化物、乙酸乙酯萃取經(jīng)大孔樹脂純化物和乙酸乙酯萃余經(jīng)大孔樹脂純化物的純度分別為36.65%、34.87%、59.72%、81.09%、80.43%。在樣品濃度為0.05 mg/mL時，粗提液和上述樣品對DPPH·的清除率分別為77.50%、93.01%、82.03%、88.63%、74.21%、79.52%；在樣品濃度為0.50 mg/mL時，粗提液和上述樣品對· OH的清除率分別為72.09%、60.88%、64.78%、76.55%、58.38%、67.94%。

關(guān)鍵詞 蕨麻；單寧；分離純化；抗氧化活性；大孔吸附樹脂

中圖分類號 R 284? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）12-0142-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.033

Study on Isolation，Purification and Antioxidant Activities of Tannins of Potentilla anserina

QU Jun-ru1，2，3， LI Jun-qiao1，2，3，TIAN Tian1，2，3 et al

（1.College of Ecological Environment and Resources， Qinghai Nationalities University，Xining，Qinghai 810007;2.Qinghai Plateau Crop Germplasm Resources Research and Utilization Laboratory，Xining，Qinghai 810007;3.Key Laboratory of High-value Utilization of Characteristic Economic Plants， Qinghai Province，Xining，Qinghai 810007）

Abstract The macroporous adsorption resin method and organic solvent extraction method were used to separate and purify the tannin components from root tuber of Potentilla anserina， and the scavenging ability of tannin samples obtained under different purification methods for DPPH· and·OH was investigated.The result showed that the optimal process conditions for purifying the tannin from root tuber of Potentilla anserina with macroporous resin： select X-5 macroporous resin， the flow rate of sample was 1.0 mL/min， the feed concentration of sample was 1.01 mg/mL， the desorption solvent was 60% ethanol solution， and the flow rate was 1.5 mL/min.The purity of ethyl acetate extract， ethyl acetate residue， macroporous resin purification， ethyl acetate extract purified by macroporous resin， and ethyl acetate residue purified by macroporous resin were 36.65%， 34.87%， 59.72%， 81.09% and 80.43%， respectively.At a sample concentration of 0.05 mg/mL， the scavenging rates of the crude extract and the above samples for DPPH· were 77.50%， 93.01%， 82.03%， 88.63%， 74.21% and 79.52%， respectively;at a sample concentration of 0.50 mg/mL， the scavenging rates of crude extract and the above samples for·OH were 72.09%， 60.88%， 64.78%， 76.55%， 58.38% and 67.94%， respectively.

Key words Potentilla anserina;Tannins;Isolation and purification;Antioxidant activity;Macroporous resin

基金項目

青海省自然科學(xué)基金計劃-創(chuàng)新團隊項目（2022-ZJ-902）；青海民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項目（54M2021004）。

作者簡介 曲俊儒（1997—），女，遼寧沈陽人，碩士研究生，研究方向：植物資源開發(fā)與利用。*通信作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事植物資源開發(fā)與利用研究。

收稿日期 2022-12-18

蕨麻（Potentilla anserina L.）為鵝絨委陵菜的變種，屬薔薇科（Rosacrae）委陵菜屬（Potentilla），廣泛分布于我國青海、西藏等高海拔地區(qū)，其塊根中富含多種活性成分，具有廣闊的科研前景。蕨麻塊根中分離得到的野薔薇苷、刺梨苷等單體成分，已證實具有較好的抗疲勞和抗缺氧作用［1-2］。單寧多存在于植物的莖、葉、表皮、果實等組織中，一般分為縮合單寧和水解單寧兩大類［3］，是一種分子量為500～3 000 Da的多元酚類次生代謝物［4］。單寧類化合物具有多種藥理作用，如抗菌、抗氧化、抗過敏、抗炎、抗癌、抗哮喘、免疫調(diào)節(jié)等［5-7］，還可以阻礙單純皰疹病毒（HSV）和艾滋病毒（HIV）對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞病變［4，8］。其中沒食子單寧和鞣花單寧可作口服劑用于抑制艾滋?。ˋIDS），效果優(yōu)于合成的AIDS藥物［9-10］;鞣花酸單寧和部分原花青素還可以作為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，抑制乙型肝炎病毒感染細(xì)胞中E抗原的分泌［11］。此外，單寧類化合物還被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、膠黏劑、皮革、動物飼料等行業(yè)；因其獨特口感在葡萄酒、茶、咖啡等飲料產(chǎn)品的研發(fā)中也有著不可替代的作用［12］。

目前，蕨麻中活性成分（總黃酮、總生物堿、多糖、皂苷）和營養(yǎng)成分（淀粉、粗蛋白、氨基酸、粗纖維、維生素、礦質(zhì)元素）等方面的研究均已較為完善，對其中單寧成分的研究仍較少，尚未進(jìn)行分離純化等相關(guān)工作［13-23］。常見的單寧純化方法有大孔吸附樹脂法、膜分離法、萃取分離法、色譜法等，其中大孔樹脂法因其成本低、耗能小、操作簡單等優(yōu)點被大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中［24-27］。因此，該試驗采用大孔吸附樹脂純化法、乙酸乙酯萃取分離法及二者聯(lián)用方法對蕨麻塊根中單寧成分進(jìn)行分離提純，并考察不同純化方法得到單寧的抗氧化活性，建立高效簡便的蕨麻單寧純化工藝流程，為后續(xù)進(jìn)一步研究提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材與試劑。蕨麻塊根，2021年9月采自青海省西寧市湟源縣蕨麻種植基地；鎢酸鈉；鉬酸鈉；磷酸；鹽酸；硫酸鋰；無水碳酸鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品；1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）；抗壞血酸，上海源葉生物科技有限公司；X-5、D101、HP-20、HPD-400、S-8、HPD-826型大孔樹脂，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀器。UV-5500型紫外-可見光分光光度計，上海元析儀器有限公司；Neofuge23Ｒ臺式高速冷凍離心機，上海力申科學(xué)儀器有限公司；BT102S微型蠕動泵，保定雷弗流體科技有限公司；SHT-40A超聲波清洗器，深圳市深華泰超聲清洗設(shè)備有限公司；HZQ-X160恒溫震蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；RE101-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，大龍興創(chuàng)試驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蕨麻塊根單寧提取。

1.2.1.1 脫脂蕨麻粉末的制備。

取新鮮青海蕨麻3號塊根于恒溫干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎過篩（60目），稱取適量干燥蕨麻粉末置石油醚（1∶4）中常溫浸泡48 h，待粉末脫脂后減壓回收石油醚，得到蕨麻供試粉末，干燥密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 蕨麻粗提液的制備。

精密稱取已預(yù)處理的蕨麻供試粉末，加入50%乙醇溶液（1∶20），于超聲功率800 W、溫度60 ℃條件下提取90 min，過濾，得到蕨麻塊根粗提液，保存?zhèn)溆茫?8-30］。

1.2.2 單寧的定性及定量分析。

1.2.2.1 定性分析。

取適量粗提液和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)行單寧的FeCl3顏色反應(yīng)、明膠沉淀反應(yīng)和甲醛-鹽酸共沸沉淀反應(yīng)，對蕨麻塊根粗提液中單寧成分進(jìn)行初步定性分析。

1.2.2.2 定量分析。

精密稱取10.20 mg單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品于500 mL 容量瓶中，依次吸取5、10、15、20、25、30 mL于50 mL容量瓶中定容，得到0.002 04、0.004 08、0.006 12、0.008 16、0.010 20、0.012 24 mg/mL系列濃度的單寧酸溶液，采用鎢酸鈉-鉬酸鈉法［27］顯色，于最大吸收波長處測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。以單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取定量粗提液稀釋后依上述方法顯色測定吸光度，根據(jù)線性方程及公式（1）［31］計算單寧得率（W）。

W=V×c×V1M×V2×103×100%（1）

式中，V為稀釋用容量瓶的體積（mL）；c為單寧含量（mg/mL）；V1為提取液總體積（mL）；V2為稀釋液體積（mL）；M為蕨麻塊根供試粉末的質(zhì)量（g）。

1.2.3 蕨麻單寧的分離與純化。

1.2.3.1 大孔樹脂的靜態(tài)篩選。

稱取已預(yù)處理的D101、X-5、S-8、HP-20、HPD-400、HPD-826型樹脂各2 g，分別裝入150 mL錐形瓶中，然后加入40 mL質(zhì)量濃度為0.81 mg/mL單寧粗提液，置于搖床中（30 ℃、110 r/min），振蕩吸附24 h后抽濾，適量蒸餾水清洗2次，然后用60%乙醇40 mL對樹脂進(jìn)行振蕩解吸，分別測定濾液及解吸液中單寧含量。按照公式（2）～（4）分別計算大孔樹脂的吸附率、吸附量及解吸率。

1.2.3.2 洗脫劑濃度對樹脂靜態(tài)解吸的影響。稱取已預(yù)處理的X-5型大孔樹脂2 g（共6份），裝入150 mL錐形瓶中，加入40 mL質(zhì)量濃度為0.81 mg/mL單寧粗提液，置于搖床中（30 ℃、110 r/min），振蕩吸附24 h后抽濾，適量蒸餾水清洗2次，然后用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇40 mL對樹脂進(jìn)行振蕩解吸，分別測定濾液及解吸液中單寧的含量，計算不同溶液濃度下樹脂的解吸率。

1.2.3.3 X-5型樹脂為填料的蕨麻單寧的分離工藝考察。

稱取10 g已預(yù)處理的X-5型大孔樹脂濕法裝入層析柱（Φ 1.5 cm×30.0 cm）中，充分平衡后上樣（1.01 mg/mL，100 mL），以恒流泵控制上樣速度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，動態(tài)吸附后測定流出液中單寧含量。保持上樣流速1.0 mL/min、上樣體積100 mL，改變上樣質(zhì)量濃度分別為0.41、0.63、0.81、1.01、1.13、1.33、1.51 mg/mL，動態(tài)吸附后測定流出液中單寧含量。再以流速1.0 mL/min、體積100 mL和質(zhì)量濃度1.01 mg/mL上樣，吸附完成后使用50 mL蒸餾水沖洗柱子，再改變洗脫流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，洗脫液體積均為100 mL，測定洗脫液中單寧含量。

1.2.3.4 溶劑萃取法分離純化蕨麻單寧。

取100 mL蕨麻粗提液于40 ℃減壓干燥，粗提物用10 mL 50%乙醇溶液溶解后加入無水乙醇40 mL，充分混合后室溫靜置24 h后離心（4 200 r/min，10 min），于40 ℃下回收乙醇，得到除去多糖蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的單寧濃縮液。再繼續(xù)用等體積的石油醚和氯仿分別萃取3次，收集水相，減壓濃縮，得到除去脂類及色素等雜質(zhì)的單寧樣品。最后，加入適量蒸餾水溶解得到的單寧樣品，用等體積的乙酸乙酯萃取6次，收集萃取相和萃余相，減壓濃縮，分別保存為乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃余物。

1.2.3.5 有機溶劑萃取-大孔樹脂吸附聯(lián)用法分離純化蕨麻單寧。取“1.2.3.4”中所得的乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃余物作為上樣液，取已預(yù)處理的X-5型大孔樹脂10 g濕法裝入層析柱（Φ 1.5 cm×30.0 cm）；分別精密稱取蕨麻單寧乙酸乙酯萃取樣品和乙酸乙酯萃余樣品0.276和0.290 g，加入100 mL 50%乙醇溶液溶解；另取60%乙醇溶液100 mL作為洗脫液，保持上樣流速為1.0 mg/mL、洗脫流速為1.5 mg/mL，對蕨麻單寧樣品進(jìn)行二次分離純化，得到萃余經(jīng)大孔樹脂純化物和萃取經(jīng)大孔樹脂純化物。

1.2.3.6 驗證純化效果試驗。

依上述試驗條件，通過多種純化方法分別得到不同蕨麻單寧樣品，測定其中單寧含量，每組重復(fù)3次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和恒溫干燥箱對其進(jìn)行減壓濃縮并烘干至恒重，稱重，計算樣品中單寧的純度：純度=純化樣品中單寧含量（mg）/純化樣品總質(zhì)量（mg）×100%。

1.2.4 蕨麻單寧抗氧化活性測定。

依據(jù)文獻(xiàn)［28］方法，分別配制0.01～0.05和0.10～0.50 mg/mL系列濃度的不同樣品溶液，與抗壞血酸進(jìn)行比較，分別測定各溶液對DPPH·和·OH的清除作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧的定性與定量分析

2.1.1 定性分析。

分別于單寧酸溶液和蕨麻粗提液中加入1%明膠溶液后，二者均出現(xiàn)了白色絮狀物；于粗提液中加入0.3% FeCl3溶液，試管中溶液變?yōu)樗{(lán)黑色；加入40%甲醛溶液與2 mL濃硫酸沸水浴反應(yīng)后出現(xiàn)紅褐色沉淀。以上定性試驗均出現(xiàn)單寧顯色反應(yīng)，初步確定粗提液中含單寧類成分，且大部分為水解單寧。

2.1.2 定量分析。

分別對單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液和蕨麻粗提液進(jìn)行顯色反應(yīng)后，用紫外-可見光分光光度計于650～850 nm處掃描，二者均于760 nm處存在最大吸收，因此確定設(shè)定波長為760 nm 進(jìn)行后續(xù)溶液吸光度測定。以吸光度（A）和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度（c）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=0.086 5c-0.010 5（R2=0.995 2）。由此得到蕨麻塊根中單寧含量為2.73%。

2.2 蕨麻單寧分離純化工藝

2.2.1 大孔樹脂的靜態(tài)篩選。

以各型號大孔樹脂的吸附率、解吸率及吸附量為評價指標(biāo)，篩選試驗樹脂類型，結(jié)果如表1所示。在相同試驗條件下，X-5型大孔樹脂對蕨麻塊根單寧的靜態(tài)吸附效果最好，吸附率為83.64%，解吸率為90.36%；其中HPD-826型大孔樹脂對蕨麻單寧吸附率最高，達(dá)到84.95%，但解吸率較差，為84.49%；而HP-20型大孔樹脂解吸率（91.72%）略高于X-5型大孔樹脂，其吸附率（70.49%）卻遠(yuǎn)低于X-5型大孔樹脂。綜合多種指標(biāo)考慮，選擇X-5型大孔樹脂用于后續(xù)蕨麻塊根單寧純化試驗。

2.2.2 洗脫劑濃度對樹脂靜態(tài)解吸的影響。

以不同濃度乙醇溶液作為洗脫劑，研究其質(zhì)量分?jǐn)?shù)對樹脂解吸率的影響（圖1）。一般來說，大孔樹脂的色譜行為具有反向的性質(zhì)，而單寧類物質(zhì)易與大孔樹脂之間產(chǎn)生氫鍵作用，單用水作洗脫劑效果不好，需要水與乙醇以合適配比與樹脂進(jìn)行交換，才能更好地將單寧物質(zhì)洗脫下來［3］。由圖1可知，隨著洗脫劑中乙醇濃度的上升，X-5型樹脂的解吸率逐步上升，于乙醇濃度60%時達(dá)到峰值，當(dāng)乙醇濃度大于60%時，開始逐步下降，但高濃度乙醇溶液的洗脫能力均高于低濃度乙醇溶液，故選擇60%乙醇溶液作為最佳洗脫劑。

2.2.3 以X-5型樹脂為填料的蕨麻單寧的分離工藝考察。

2.2.3.1 不同流速對單寧吸附及解吸的影響。

上樣和洗脫流速均會對樹脂的吸附率和解吸率造成影響。一般認(rèn)為，上樣流速過大使得物質(zhì)與樹脂的交換時間較短，來不及被吸附就已流出樹脂柱［31］，從而導(dǎo)致吸附量降低，該試驗結(jié)果（圖2）與之相符；隨著上樣流速的增大，樹脂的吸附率逐漸降低，當(dāng)上樣流速大于1.0 mL/min時，樹脂的吸附率急劇下降。同樣，過快的洗脫液流速也會對樹脂的解吸率造成影響，由圖2可知，當(dāng)洗脫流速小于1.5 mL/min時，解吸率均在93%以上，當(dāng)洗脫流速大于1.5 mL/min后，解吸率急劇下降，當(dāng)洗脫流速達(dá)到3.0 mL/min時，樹脂的解吸率低至65.5%。由試驗可知，低流速增加接觸時間，有利于樹脂與樣品進(jìn)行物質(zhì)交換，但考慮低流速耗時長、效率低等原因，最終選擇1.0 mL/min作為最佳上樣流速，1.5 mL/min為最適洗脫流速。

2.2.3.2 上樣液質(zhì)量濃度對單寧吸附的影響。

由圖3可知，

上樣液質(zhì)量濃度對樹脂吸附性能影響較大。隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，吸附量逐步上升，而吸附率逐漸下降。降低上樣液質(zhì)量濃度會導(dǎo)致樹脂的工作效率不高，不能充分發(fā)揮樹脂的吸附能力；而較高的上樣液質(zhì)量濃度則會使吸附率降低，雖具有較高的吸附量，但吸附效果不佳。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.01 mg/mL時，吸附率達(dá)到92.33%，吸附量為9.33 mg/g，二者均處于較高的水平；而當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.13 mg/mL時，吸附量和吸附率分別達(dá)到10.27 mg/g和90.88%，大孔樹脂也處于較好的工作狀態(tài)。但考慮到實際生產(chǎn)生活中對試驗材料的使用情況，選擇較低的上樣液質(zhì)量濃度1.01 mg/mL作為蕨麻單寧最適的上樣液質(zhì)量濃度。

2.2.4 不同純化方法對單寧純度的影響。通過不同純化方法得到的單寧樣品純度存在差異。經(jīng)試驗測定，粗提液樣品的單寧純度為9.33%，大孔樹脂純化樣品的單寧純度為59.72%，乙酸乙酯萃取樣品的單寧純度為36.65%，乙酸乙酯萃余樣品的單寧純度為32.87%，萃取樣品和萃余樣品分別經(jīng)大孔樹脂二次純化后得到的樣品單寧純度分別為81.09%和75.43%。粗提液經(jīng)大孔樹脂純化和萃取分離后，樣品純度均有較大提高，其中經(jīng)大孔樹脂純化的單寧樣品表現(xiàn)更佳，純度可以達(dá)到原來的6.4倍。此外，采用大孔樹脂與乙酸乙酯萃取聯(lián)用的二次純化方法也可以有效提高蕨麻塊根中單寧提取物的純度。

2.3 蕨麻單寧的抗氧化活性

2.3.1 DPPH·的清除效果考察。

圖4顯示，6種樣品對DPPH·的清除能力均隨著樣品濃度的增大而提高，在濃度為0.05 mg/mL時達(dá)到最大。同等濃度下，各純化方法得到的蕨麻單寧樣品的清除能力均強于抗壞血酸溶液，具有較好的活性。當(dāng)樣品濃度為0.05 mg/mL時，各樣品對DPPH·的清除率從大到小依次為單寧酸（93.65%）＞乙酸乙酯萃取物（93.01%）＞大孔樹脂純化物（88.63%）＞乙酸乙酯萃余物（82.03%）＞萃取經(jīng)大孔樹脂純化物（79.52%）＞粗提液（77.50%）＞萃余經(jīng)大孔樹脂純化物（74.21%）＞抗壞血酸（66.84%）。所有樣品對DPPH·的清除率均低于同等濃度下的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中粗提液經(jīng)乙酸乙酯萃取制得的樣品溶液抗氧化能力最高，與單寧酸較為接近。在濃度0.05 mg/mL 時，乙酸乙酯萃取得到的樣品溶液對DPPH·的清除率達(dá)到93.01%，是抗壞血酸溶液的1.4倍；同等濃度下，單寧酸溶液對DPPH·的清除率為93.65%，粗提液及其經(jīng)大孔樹脂純化樣品的清除率分別為77.50%和88.63%。由此可見，適當(dāng)?shù)募兓椒茱@著提高蕨麻單寧對DPPH·的清除能力，其中乙酸乙酯萃取方法純化的單寧樣品對DPPH·的清除能力較優(yōu)。對比圖4也可以看出，多次通過大孔樹脂及有機溶劑萃取的操作可能導(dǎo)致樣品溶液中部分單寧的活性降低［3］，甚至低于未經(jīng)純化處理的粗提液，在實際工作中可依據(jù)情況縮減純化次數(shù)。

2.3.2 · OH的清除效果考察。由圖5可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，6種樣品溶液對·OH均具有較好的清除能力。當(dāng)樣品濃度為0.50 mg/mL時，各樣品對·OH的清除率從大到小依次為抗壞血酸（95.81%）＞大孔樹脂純化物（76.55%）＞粗提液（72.09%）＞萃余經(jīng)大孔樹脂純化物（67.94%）＞單寧酸（65.99%）＞乙酸乙酯萃余物（64.78%）＞乙酸乙酯萃取物（60.88%）＞萃取經(jīng)大孔樹脂純化物（58.38%）。其中，抗壞血酸溶液對·OH的清除能力極強，在濃度為0.50 mg/mL時清除率達(dá)到了95.81%，而第二位的大孔樹脂純化樣品僅為76.55%。在對·OH的清除試驗中，經(jīng)大孔樹脂純化得到的樣品溶液的抗氧化能力高于經(jīng)乙酸乙酯萃取得到的樣品溶液；且部分樣品的清除率高于相同濃度的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，有別于DPPH·的清除試驗。從圖5可以看出，所有經(jīng)過乙酸乙酯萃取操作的純化樣品對·OH的清除能力均小于未經(jīng)處理的粗提液。大孔樹脂純化和乙酸乙酯萃取2種純化方法除去的雜質(zhì)成分存在差異，其中可能包括部分強抗氧化活性成分，導(dǎo)致不同純化樣品間對DPPH·和·OH的清除效果變化較大。

3 結(jié)論

該研究探討了大孔樹脂純化和有機溶劑萃取2種方法對蕨麻塊根單寧成分的分離純化情況。首先考察了大孔樹脂型號、上樣濃度、洗脫濃度、上樣流速和洗脫流速等因素對蕨麻單寧純化效果的影響；其中X-5型大孔樹脂對蕨麻單寧的分離純化效果最好，且最佳上樣濃度為1.01 mg/mL、上樣流速為1.0 mg/mL、洗脫流速為1.5 mg/mL、洗脫劑為60%乙醇溶液。通過比較大孔吸附樹脂、有機溶劑萃取等不同純化方法對提高蕨麻單寧樣品純度的效果，證明大孔樹脂吸附和乙酸乙酯萃取二者聯(lián)用的方法可以顯著提高蕨麻單寧樣品純度；但純化步驟較多，會導(dǎo)致所得樣品中單寧成分的抗氧化活性降低，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中還需進(jìn)一步考量。

在抗氧化活性試驗中，蕨麻單寧對DPPH·和·OH均表現(xiàn)出較好的清除能力，對DPPH·的清除能力甚至遠(yuǎn)高于同等濃度下的抗壞血酸溶液，未來可作為一種天然的抗氧化劑投入更廣闊的開發(fā)和利用。蕨麻單寧對DPPH·的清除率略低于相同濃度的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，說明初步的大孔吸附樹脂及有機溶劑萃取等分離純化方法雖能有效提高單寧樣品的純度，但蕨麻塊根中所含單寧類物質(zhì)種類繁多，后續(xù)可使用更精細(xì)的分離操作得到抗氧化活性更強的單體物質(zhì)，針對性地應(yīng)用于各種研究生產(chǎn)中。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李軍喬，蔡光明，李靈芝.中國蕨麻［M］.北京：科學(xué)出版社，2020.

［2］ 李軍喬.野生資源植物——蕨麻（Potentilla Anserina L.）的生物學(xué)特性及應(yīng)用研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

［3］ 屈戀，高璇，劉雄民，等.檸檬桉果實單寧的提取純化及抗氧化活性［J］.食品工業(yè)科技，2017，38（8）：256-261.

［4］ 舒暢，趙韓棟，焦文曉，等.植物單寧的生物活性研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2018，39（17）：328-334.

［5］ NILE S H，PARK S W.Edible berries：Bioactive components and their effect on human? health［J］.Nutrition，2014，30（2）：134-144.

［6］ SMERIGLIO A，MONTELEONE D，TROMBETTA D.Health effects of Vaccinium myrtillus L.：Evaluation of efficacy and technological strategies for preservation of active ingredients［J］.Mini reviewsin medicinal chemistry，2014，14（7）：567-584.

［7］ SIENIAWSKA E.Activities of tannins： From in vitro studies to clinical trials［J］.Natural product communications，2015，10（11）：1877-1884.

［8］ BAKKIYARAJ D，NANDHINI J R，MALATHY B，et al.The anti-biofilm potential of pomegranate （Punica granatum L.） extract against human bacterial and fungal pathogens［J］.Biofouling，2013，29（8）：929-937.

［9］ KILKUSKIE? R E，KASHIWADA Y，NONAKA G，et al.HIV and reverse transcriptase inhibition by tannins［J］.Bioorganic & medicinal chemistry letters，1992，2（12）：1529-1534.

［10］ 畢良武，吳在嵩，陳笳鴻，等.單寧在抗艾滋病研究中的應(yīng)用［J］.林產(chǎn)化工通訊，1998，32（2）：11-15.

［11］ MARN L，MIGULEZ E M，VILLAR C J，et al.Bioavailability of dietary polyphenols and gut microbiota metabolism：Antimicrobial properties［J］.BioMed research international，2015，2015：1-19.

［12］ 豆佳媛，王奇，馮鞏.植物單寧的應(yīng)用及其研究進(jìn)展［J］.飲料工業(yè)，2014，17（6）：51-54.

［13］ 陳炅然，王琴.蕨麻多糖的提取及其清除自由基的作用［J］.中國獸醫(yī)科技，2004，34（4）：59-62.

［14］ 韋薇，李廣策，龔海英，等.蕨麻多糖抗缺氧作用研究［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，19（5）：345-347，373.

［15］ 張永慧，李月春，王寶軍，等.蕨麻多糖對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2014，46（4）：385-388.

［16］ 謝學(xué)淵，王強.蕨麻提取物抗衰老作用研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2007，36（8）：734-736.

［17］ 羅慧英，黃亞紅，朱麗娟，等.藏藥蕨麻對實驗性酒精肝損傷小鼠的保護作用研究［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19（10）：1107-1110.

［18］ 張新全，趙艷玲，山麗梅，等.蕨麻素對化學(xué)性肝損傷保護作用機制的研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2004，20（4）：259-261.

［19］ 趙艷玲，蔡光明，胡琳，等.中藥制劑賦肝能對小鼠實驗性肝損傷的保護作用［J］.中國藥學(xué)雜志，2001，36（7）：448-450.

［20］ 陳曄，吳宇強，王耀博，等.HPLC-ELSD法測定不同產(chǎn)地、不同等級蕨麻中野薔薇苷和刺梨苷的含量［J］.武警后勤學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2018，27（8）：642-646.

［21］ 陳曄，劉丹，李靈芝，等.蕨麻多酚對血管內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪損傷的改善作用研究［J］.中國藥業(yè)，2019，28（14）：4-7.

［22］ 劉迪.蕨麻黃酮對鎘氧化毒性介導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的干預(yù)作用及其機制研究［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2020.

［23］ 秦曉靜，呂琪，張新寧，等.蕨麻乙醇提取物抑制大鼠急性心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡［J］.中國中藥雜志，2012，37（9）：1279-1284.

［24］ 杜凱，馬養(yǎng)民，郭林新，等.大孔吸附樹脂純化杏仁皮單寧工藝的研究［J］.應(yīng)用化工，2020，49（5）：1183-1186，1190.

［25］ 王玉增，劉彥.植物單寧研究進(jìn)展綜述［J］.西部皮革，2014，36（16）：23-30.

［26］ 王紅，陳秀秀，劉軍海.單寧的提取純化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.遼寧化工，2011，40（8）：864-866，870.

［27］ 李知陸，康欣，李哲，等.元寶楓葉中單寧的含量測定［J］.食品研究與開發(fā)，2019，40（9）：177-180.

［28］ 陳薈蕓.肉桂單寧提取分離純化及抗氧化活性研究［D］.南寧：廣西大學(xué)，2014.

［29］ 李宗仁，李軍喬，馬本雙.收獲時間對鵝絨委陵菜塊根鞣質(zhì)含量的影響研究［J］.陜西林業(yè)科技，2003（4）：11-13.

［30］ 葉桐，賈有青.香菇中酚類物質(zhì)的微波提取工藝的研究［J］.食品工程，2015（2）：16-18，30.

［31］ 尚俊，馮秀云，王鑫，等.檸檬桉樹皮單寧的提取純化及抗氧化活性［J］.食品工業(yè)科技，2018，39（1）：62-69.