高曉燕,廖瑩瑩

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心,湖北十堰 442000

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(ROU)常發(fā)于口腔黏膜中,患病率可高達20%,女性高于男性,給患者帶來極大的困擾[1-2]。目前ROU治療方法主要以局部治療和全身治療為主,但治療效果均不佳,患者依從性較差[3]。近年來,中醫(yī)藥以成本低、不良反應(yīng)小在臨床治療上被廣泛使用,尤其是在ROU的治療上發(fā)揮較大的作用[4]。研究證明柚皮苷具有多種生物活性,但是在口腔潰瘍疾病的治療中研究較少[5]。研究表明炎癥介質(zhì)和生長因子在很大程度上影響口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展,如甘美達可能通過抑制潰瘍組織中炎癥介質(zhì)的釋放,升高生長因子的表達,改善口腔潰瘍[6]。本研究旨在探索柚皮苷對ROU大鼠潰瘍組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)、白細(xì)胞介素(IL)-6水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料 于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司購買6周齡、清潔級、雌雄各半的SD大鼠72只(體重180～210 g),許可證號:SCXK(蘇)2019-0007。飼養(yǎng)條件:溫度22～25 ℃,濕度40%～60%,自由飲水進食。

1.2儀器與試劑 于北京六一儀器廠購買轉(zhuǎn)膜儀,于美國Bio-Rad公司購買MODEL-550型酶標(biāo)儀。于四川省維克奇生物科技有限公司購買柚皮苷(CAS號:10236-47-2),于Merck公司購買完全弗氏佐劑(貨號:F5881),于華中藥業(yè)股份有限公司購買醋酸潑尼松龍注射液(國藥準(zhǔn)字:H42021216),于北京雷根生物技術(shù)有限公司購買蘇木精-伊紅(HE)染色液(貨號:DH0006),于上海通蔚實業(yè)有限公司購買IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號:TW3160)、EGF ELISA試劑盒(貨號:TW24682),于上海紀(jì)寧實業(yè)生物科技有限公司購買TNF-α ELISA試劑盒(貨號:JN110),于Abcam公司購買TNF-α(貨號:ab215188)、EGF(貨號:ab184265)、IL-6(貨號:ab233706)一抗。

1.3方法

1.3.1ROU大鼠的制備、分組及給藥 參照高峻鷹等[7]操作方法制備ROU大鼠模型:隨機選取12只大鼠,在大鼠口腔黏膜處注射生理鹽水,該操作于無菌條件下進行,剝離口腔黏膜置于研磨器中,分別向其中加入PBS緩沖液(0.1 mL,pH值為7.4)、完全弗氏佐劑,混合均勻直至乳狀液無分層即可得到組織乳化劑備用。隨機選取50只大鼠建立ROU大鼠模型,將大鼠脫毛去皮,于脊柱兩側(cè)經(jīng)皮內(nèi)注射組織乳化劑,將剩余10只正常大鼠作為對照組,給予對照組大鼠注射等體積的生理鹽水,每次0.1 mL,1次/周,連續(xù)8周。當(dāng)大鼠的頰黏膜、口底、唇黏膜等部位出現(xiàn)多個橢圓或圓形潰瘍面,且潰瘍表面的假膜直徑約1～2 mm、顏色呈現(xiàn)灰黃色時,即表明ROU大鼠模型制備成功[7]。50只大鼠均符合上述建模成功的條件。將大鼠隨機分為模型組、柚皮苷低劑量(25 mg/kg)組、柚皮苷中劑量(50 mg/kg)組、柚皮苷高劑量(100 mg/kg)組[8]、陽性對照組,10只/組。柚皮苷劑量組給予腹腔注射相應(yīng)劑量的柚皮苷干預(yù),陽性對照組給予20 mL/kg醋酸潑尼松龍注射液灌胃干預(yù)[7],對照組、模型組給予等體積的生理鹽水,1次/天,連續(xù)干預(yù)20 d。

1.3.2觀察大鼠潰瘍情況 干預(yù)結(jié)束后,觀察大鼠潰瘍持續(xù)時間、數(shù)量及間隔時間,游標(biāo)卡尺測定各組大鼠第0、10、20天潰瘍面積的變化。

1.3.3收集標(biāo)本 潰瘍面積測定完成后,麻醉并處死大鼠,經(jīng)腹部主動脈取血,靜置、離心,取上清液,置于-40 ℃冰箱儲存,用于ELISA試劑盒檢測;切取各組大鼠潰瘍組織,一部分置于甲醛溶液中固定,用于HE染色檢驗其病理學(xué)變化;另一部分置于-80 ℃冰箱中保存,用于后續(xù)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)及免疫組化法檢測TNF-α、IL-6和EGF水平。

1.3.4HE染色檢測潰瘍組織病理學(xué)變化 取上述1.3.3中潰瘍組織,經(jīng)脫水、包埋、制作切片,行HE染色、脫水、封片,于顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.3.5ELISA檢測血清中TNF-α、EGF和IL-6水平 取上述1.3.3中各組大鼠血清標(biāo)本,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中TNF-α、EGF和IL-6水平。

1.3.6免疫組化法檢測大鼠潰瘍組織中TNF-α、EGF和IL-6表達 取上述1.3.3中的潰瘍組織,制備切片,切片常規(guī)脫蠟,加入3%H2O2孵育10 min,加入稀釋后的TNF-α、EGF和IL-6一抗,4 ℃孵育過夜,室溫孵育30 min,TBST洗滌,加入二抗37 ℃孵育1 h,PBS清洗,室溫下采用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復(fù)染,二甲苯透明,中性樹脂封片,拍照,觀察潰瘍組織中TNF-α、EGF和IL-6陽性表達。

1.3.7Western blot檢測各組大鼠潰瘍組織中TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平 取上述1.3.3中的潰瘍組織,勻漿,離心提取并測定總蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化、轉(zhuǎn)膜、5%TBST脫脂奶粉封閉;封閉后洗膜,加入稀釋后TNF-α、EGF和IL-6一抗,4 ℃恒溫箱過夜;TBST洗滌,將膜放入到稀釋后的二抗室溫孵育1 h,ECL顯色,拍照,以β-actin為內(nèi)參,分析TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1柚皮苷對ROU大鼠潰瘍情況的影響 與模型組比較,柚皮苷低、中、高劑量組大鼠口腔潰瘍持續(xù)時間、數(shù)量均逐漸減少(P<0.05),間隔時間逐漸增加(P<0.05);與陽性對照組比較,柚皮苷高劑量組各項指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠口腔潰瘍情況比較

2.2柚皮苷對ROU大鼠潰瘍面積的影響 與模型組比較,柚皮苷低、中、高劑量組,在干預(yù)后第0天大鼠口腔潰瘍面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在干預(yù)后第10、20天大鼠口腔潰瘍面積逐漸減少(P<0.05),且以柚皮苷高劑量組變化最為明顯,但與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與干預(yù)后第0天比較,干預(yù)后第10、20天各組大鼠口腔潰瘍面積均減少(P<0.05)。與干預(yù)后第10天比較,干預(yù)后第20天各組大鼠口腔潰瘍面積也減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠口腔潰瘍面積比較

2.3柚皮苷對ROU大鼠潰瘍組織病理學(xué)變化的影響 對照組大鼠無口腔潰瘍發(fā)生;與對照組比較,模型組大鼠出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤,潰瘍面積較大;與模型組比較,柚皮苷低、中、高劑量組大鼠炎癥浸潤逐漸減少,潰瘍面積逐漸愈合,有纖維細(xì)胞、結(jié)締組織形成;與陽性對照組比較,柚皮苷高劑量組無明顯差異。見圖1。

注:A～F分別為對照組、模型組、柚皮苷低、中、高劑量組、陽性對照組ROU大鼠潰瘍組織病理學(xué)變化。

2.4柚皮苷對ROU大鼠血清中TNF-α、EGF和IL-6水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05),EGF水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮苷低、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-6水平逐漸降低(P<0.05),EGF水平逐漸升高(P<0.05);與陽性對照組比較,柚皮苷高劑量組TNF-α、EGF和IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中的TNF-α、EGF和IL-6水平比較

2.5柚皮苷對ROU大鼠潰瘍組織中TNF-α、EGF和IL-6陽性表達的影響 免疫組化法檢測TNF-α、EGF和IL-6陽性表達均為棕褐色或棕黃色顆粒。與對照組比較,模型組TNF-α、IL-6陽性表達增強,棕褐色或棕黃色顆粒明顯增多,EGF陽性表達減弱,棕褐色或棕黃色顆粒較少;與模型組比較,柚皮苷低、中、高劑量組TNF-α、IL-6陽性表達減弱,棕褐色或棕黃色顆粒明顯減少,EGF陽性表達增強,棕褐色或棕黃色顆粒逐漸增多;與陽性對照組比較,柚皮苷高劑量組TNF-α、EGF和IL-6陽性表達無明顯差異。見圖2～4。

注:A～F分別為對照組、模型組、柚皮苷低、中、高劑量組、陽性對照組大鼠潰瘍組織TNF-α免疫組化染色圖。

注:A～F分別為對照組、模型組、柚皮苷低、中、高劑量組、陽性對照組大鼠潰瘍組織EGF免疫組化染色圖。

注:A～F分別為對照組、模型組,柚皮苷低、中、高劑量組,陽性對照組大鼠潰瘍組織IL-6免疫組化染色圖。

2.6柚皮苷對ROU大鼠潰瘍組織中TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠TNF-α、IL-6蛋白水平升高(P<0.05),EGF蛋白水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮苷低、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-6蛋白水平逐漸降低(P<0.05),EGF蛋白水平逐漸升高(P<0.05);與陽性對照組比較,柚皮苷高劑量組TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、表4。

注:A為對照組;B為模型組;C為柚皮苷低劑量組;D為柚皮苷中劑量組;E為柚皮苷高劑量組;F為陽性對照組。

表4 各組大鼠潰瘍組織中的TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平比較

3 討 論

ROU是一種反復(fù)發(fā)作的疾病,在中醫(yī)學(xué)上屬于“口瘡”“口糜”等范圍。免疫功能低下的患者,一旦患有口腔潰瘍,口腔黏膜經(jīng)常會伴隨淺表性潰瘍的反復(fù)發(fā)作,影響患者的飲食甚至表達能力[9-10]。ROU的發(fā)病機制復(fù)雜,與微量元素及維生素缺乏、細(xì)菌和病毒感染、精神、飲食等多方面的因素有關(guān),目前國內(nèi)外尚無根治ROU的特效療法,以對癥治療為主,促進口腔潰瘍面積的愈合,延長發(fā)作間歇期[11-12]。本研究建立了ROU大鼠模型,當(dāng)大鼠在頰黏膜、口底、唇黏膜等部位出現(xiàn)多個橢圓或圓形潰瘍面,且潰瘍表面的假膜直徑約1～2 mm、顏色呈現(xiàn)灰黃色時,即表明ROU大鼠模型制備成功,可進入下一步的研究。

在治療ROU時,傳統(tǒng)的中草藥具有縮短病程、改善口腔潰瘍癥狀、減少復(fù)發(fā)等優(yōu)勢[13]。藥理研究表明,柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗病毒等作用[14]。AKAMO等[15]研究表明,柚皮苷可以減輕纖維化及炎癥反應(yīng),改善肝細(xì)胞功能障礙,起到護肝作用。YANG等[16]研究發(fā)現(xiàn),柚皮苷可以抑制成纖維細(xì)胞中TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,為治療炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的無菌性松動、骨溶解提供潛在價值。但柚皮苷對口腔潰瘍產(chǎn)生的炎癥因子是否影響尚未有報道。但ROU一旦發(fā)生,炎癥因子水平往往會升高,長時間的炎癥反應(yīng)會影響機體細(xì)胞生長、創(chuàng)面血管新生、創(chuàng)面愈合,甚至使機體免疫功能發(fā)生障礙,出現(xiàn)“難愈性創(chuàng)面”,故炎癥因子水平的降低對治療ROU具有關(guān)鍵作用[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤,血清中及潰瘍組織中TNF-α、IL-6水平升高,經(jīng)柚皮苷干預(yù)后,柚皮苷低、中、高劑量組大鼠潰瘍組織病理學(xué)狀況得到改善,潰瘍持續(xù)時間、數(shù)量減少,血清中及潰瘍組織中TNF-α、IL-6水平降低,間隔時間增加,潰瘍面積隨著時間及柚皮苷劑量的增加均得到改善。提示柚皮苷可以有效抑制炎癥因子水平,改善口腔潰瘍組織的病理狀況,為進一步的潰瘍愈合提供可能。

EGF主要存在于口腔黏膜的基底細(xì)胞層和棘細(xì)胞層,是機體內(nèi)的一種活性物質(zhì),對口腔黏膜起著重要的保護作用,刺激表皮生長因子受體酪氨酸激酶磷酸化,進而修復(fù)受損組織,修補增生肌膚表層細(xì)胞,最大程度地促進口腔黏膜上皮細(xì)胞的生長、分化和增殖[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組血清中及潰瘍組織中EGF水平降低;經(jīng)柚皮苷干預(yù)后,柚皮苷低、中、高劑量組血清中及潰瘍組織中EGF水平升高。說明柚皮苷可以加速血管新生,促進細(xì)胞生長增殖及潰瘍組織愈合,從而對ROU起到治療作用。

綜上所述,柚皮苷可以明顯緩解ROU病理程度,降低ROU大鼠血清及潰瘍組織中IL-6、TNF-α水平,升高EGF水平,促進ROU大鼠潰瘍愈合,但具體機制較為復(fù)雜,且遠(yuǎn)期治療效果有待進一步研究。