楊建軍,朱建光

咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學院附屬第一醫(yī)院檢驗科,湖北咸寧 437100

肝癌是發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一,該疾病具有發(fā)病速度快,病死率高等特點,一般患者確診時已至中晚期,預后較差[1]。肝癌是由多因素引起的呈多階段發(fā)展的疾病,乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)為主要引發(fā)因素,由HCV誘發(fā)的丙型肝炎病毒相關性肝癌(C-HCC)呈不斷增多的趨勢[2]。尋找與C-HCC有關的生物標志物對該疾病的診治和預后評估有重要意義。目前,外泌體與肝癌的關系是一個研究的熱點,但具體作用機制尚未明確。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長為200個堿基,但不具備編碼蛋白能力的RNA,可調控細胞的增殖、分化、凋亡等重要生理過程[3]。HEIH是最初發(fā)現在HBV中呈高表達的一種lncRNA,深入研究發(fā)現,其在多種腫瘤中上調[4]。微小RNA(miRNA)是一類長為20～25個堿基的高度保守小RNA,通過與其靶mRNA特異性結合而調控靶基因的表達[5]。有研究表明,miRNA let-7a-5p在HCV感染導致的肝硬化(HC)患者血清中顯著下調,其水平與慢性丙型肝炎肝纖維化存在密切關系[6]。以往的研究表明,lncRNA-HEIH和let-7a-5p均與HCV有關,但尚未有二者在C-HCC中的共同研究。因此,本研究通過探究外泌體lncRNA-HEIH和let-7a-5p在C-HCC患者中的表達及其在預后評估中的價值,旨在為肝癌患者的有效治療提供可靠的生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015年1月至2017年1月本院收治的76例C-HCC患者納入研究作為C-HCC組。其中,男43例,女33例;年齡為32～72歲,平均(48.64±7.82)歲;TNM分期:I～Ⅱ期47例,Ⅲ～Ⅳ期29例;35例發(fā)生淋巴結轉移,41例未轉移;18例高分化,33例中分化,25例低分化;腫瘤最大徑<5 cm 52例,≥5 cm 24例;腫瘤單發(fā)41例,多發(fā)35例。納入標準:(1)C-HCC患者符合肝癌診斷標準[7];(2)入院前未接受過抗腫瘤治療;(3)接受肝癌切除手術。排除標準:(1)伴有其他腫瘤;(2)孕婦或產婦;(3)患有其他重大器官疾病;(4)資料缺失者。另選取同期于本院治療的43例由HCV感染導致的HC患者作為HC組。其中,男24例,女19例;年齡31～72歲,平均(48.12±7.63)歲。選取同期于本院治療的52例HCV感染者作為HCV組。其中,男29例,女23例;年齡31～71歲,平均(48.08±7.54)歲。同期于本院體檢的55例健康者作為對照組。其中,男31例,女24例;年齡31～71歲,平均(48.16±7.64)歲。各組性別比例、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)。受試者及家屬均對本研究知情同意,并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 主要試劑有ExoQuick試劑盒(上海覓拓生物科技有限公司)、Trizol試劑(武漢純度生物科技有限公司)、RNA逆轉錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)、miScript SYBR?Green 實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)。引物由威斯騰生物設計并合成。主要儀器有PCR儀(西安天隆生物科技有限公司)、透射電鏡[研載生物科技(上海)有限公司]。

1.3方法

1.3.1資料收集 收集C-HCC患者的性別、年齡、TNM分期、淋巴結是否轉移、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目等資料,以及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、甲胎蛋白(AFP)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平等臨床生化指標的檢測結果。

1.3.2標本采集 血液標本采集:清晨采集患者5 mL空腹靜脈血,在3 000 r/min條件下離心10 min,保存上清液于-80 ℃?zhèn)溆?。外泌體采集:在上一步制備好的標本中加入ExoQuick溶液混勻,1 500 r/min離心30 min,去除上清液,加入PBS緩沖液對沉淀物進行洗滌,銅網上加20 μL懸液并吸干液體,復染后晾干進行外泌體形態(tài)觀察,觀察采用透射電鏡。

1.3.3外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平檢測 在外泌體樣品中加入Trizol試劑進行總RNA提取。將RNA反轉錄為cDNA,按照miScript SYBR?Green qPCR試劑盒說明書行qPCR反應,反應條件如下。95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共45個循環(huán)。lncRNA-HEIH、let-7a-5p檢測的內參分別為GAPDH、U6。相對表達水平采用2-ΔΔCt計算。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3.4隨訪 對C-HCC患者進行5年隨訪,隨訪結束時間為患者死亡或截至2022年1月,隨訪方式包括電話、微信,記錄患者生存情況。

2 結 果

2.1外泌體的形態(tài)觀察 透射電鏡下外泌體呈球形,直徑為80～100 nm,符合外泌體直徑要求,可進行下一步研究,見圖1。

圖1 透射電鏡下外泌體的形態(tài)

2.2各組外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平比較 外泌體lncRNA-HEIH水平在對照組、HCV組、HC組、C-HCC組中依次升高,而let-7a-5p水平依次降低,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平比較

2.3lncRNA-HEIH與let-7a-5p的關系 生物信息學網站ENCORI顯示,lncRNA-HEIH與let-7a-5p存在結合位點;Pearson相關性分析顯示,lncRNA-HEIH與let-7a-5p水平呈負相關(r=-0.628,P≤0.001)。見圖2、3。

圖2 lncRNA-HEIH與let-7a-5p的結合位點圖

圖3 lncRNA-HEIH與let-7a-5p水平的相關性分析

2.4lncRNA-HEIH、let-7a-5p與C-HCC患者臨床病理特征的關系 分別以lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平的平均值為臨界值,將患者分為高表達組和低表達組。外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平與C-HCC患者的性別、年齡、腫瘤分化、腫瘤數目、TBIL、ALT無關(P>0.05),與TNM分期、淋巴結是否轉移、腫瘤最大徑、AFP、AST水平有關(P<0.05)。見表3。

表3 lncRNA-HEIH、let-7a-5p與C-HCC患者臨床病理特征的關系(n)

2.5外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平與C-HCC患者預后的關系 對C-HCC患者術后行5年時間的隨訪,lncRNA-HEIH高表達組5年內累積生存率為33.33%(13/39),低于低表達組的70.27%(26/37),差異有統計學意義(P<0.05);let-7a-5p高表達組5年內累積生存率為69.44%(25/36),高于低表達組的35.00%(14/40),差異有統計學意義(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析表明,lncRNA-HEIH高表達組5年生存預后差于低表達組,let-7a-5p高表達組5年生存預后好于低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 lncRNA-HEIH與C-HCC患者預后的關系

圖5 let-7a-5p與C-HCC患者預后的關系

2.6COX回歸分析影響C-HCC患者預后的因素 單因素COX回歸分析表明,TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤最大徑、AFP、AST、lncRNA-HEIH、let-7a-5p是C-HCC患者預后不良的危險因素;多因素COX回歸分析顯示,TNM分期、AFP、lncRNA-HEIH、let-7a-5p是C-HCC患者預后不良的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 COX回歸分析影響C-HCC預后的危險因素

3 討 論

肝癌是我國臨床中常見的惡性腫瘤之一,具有早期發(fā)病不明顯,進展快,預后不佳的特點,HCV侵入肝臟后會誘發(fā)肝炎的發(fā)生,若沒有得到及時治療會發(fā)展為HC,甚至肝癌[8]。在細胞水平上,HCV引起的炎癥反應可能會影響細胞在表觀遺傳學上的變化,從而導致肝癌的發(fā)生[9]。目前,切除手術是治療肝癌的有效方式,但其高復發(fā)率和高死亡率仍是棘手的問題。因此,尋找C-HCC的生物標志物對預測患者的術后效果有重要作用。

lncRNA是一類具有較差保守性的長鏈非編碼RNA,最初被認為是基因組“噪音”,但隨著研究的深入,發(fā)現lncRNA在多種生理、病理過程中發(fā)揮重要調控作用[10]。lncRNA-HEIH作為一種功能性RNA,在HC、肝癌中發(fā)現明顯上調,已被證實為多種腫瘤的癌基因[11]。有研究表明,外泌體lncRNA-HEIH在肝細胞癌(HCC)中的表達較慢性丙型肝炎(CHC)顯著上調,且外泌體lncRNA-HEIH水平變化對診斷CHC患者肝組織病變有一定的臨床價值[12]。WU等[13]研究表明,lncRNA-HEIH在HCC組織中的表達較癌旁組織顯著上調,體外試驗表明,沉默lncRNA-HEIH可明顯抑制HCC Huh7細胞的增殖和遷移,并促使其凋亡。RUAN等[14]研究發(fā)現,lncRNA-HEIH高表達與HBV相關HC和HCC的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。在本研究中,與對照組相比,HCV組、HC組、C-HCC組患者外泌體lncRNA-HEIH水平顯著升高,與HCV組相比,HC組、C-HCC組lncRNA-HEIH水平顯著上升,且C-HCC組顯著高于HC組。進一步研究發(fā)現,其水平與腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結是否轉移、AFP、AST水平有關。提示lncRNA-HEIH參與了HCV感染后的疾病發(fā)展過程,與肝癌患者的臨床病理特征密切相關。對C-HCC患者術后行5年的隨訪,lncRNA-HEIH高表達組5年累積生存率低于低表達組。提示lncRNA-HEIH在肝癌中作為一種促癌基因會影響患者預后。另外,本研究發(fā)現TNM分期、AFP、lncRNA-HEIH是C-HCC預后不良的危險因素。提示臨床中應重點監(jiān)測上述影響患者預后的危險因素變化,準確判斷患者預后情況,合理制訂治療方案。

miRNA作為一類高保守的小RNA,可調控人類約30%的基因表達,參與細胞的增殖、分化、凋亡等重要生理活動。隨著研究的深入,發(fā)現有多種miRNA參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展,有研究在HCV相關的HC和肝癌患者的外泌體和非外泌體中檢測到了miRNA let-7a-5p的水平變化[15]。let-7a-5p在多種腫瘤中下調,LI等[16]研究發(fā)現,let-7a-5p在結直腸癌中表達下調,其機制可能為BTB和CNC同源性1(BACH1)通過調節(jié)let-7a-5p表達水平,從而促進癌細胞的生長,抑制細胞凋亡。SHI等[17]研究表明,在三陰性乳腺癌患者中l(wèi)et-7a-5p表達下調,高表達患者預后較好,提示let-7a-5p在腫瘤的增殖、轉移和有氧糖酵解中起關鍵作用。LIU等[18]研究發(fā)現,高表達的let-7a-5p可抑制人肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲,促進癌細胞的凋亡。結合本研究的結果,let-7a-5p在對照組、HCV組、HC組、C-HCC組中依次降低,且其水平與C-HCC患者的病理特征有緊密關系。提示let-7a-5p參與HCV感染患者病情發(fā)展的多個階段。另外,lncRNA-HEIH與let-7a-5p有結合位點,且二者水平呈負相關關系。提示lncRNA-HEIH可能通過調控let-7a-5p水平共同參與C-HCC的發(fā)生、發(fā)展。對C-HCC患者術后行5年時間的隨訪發(fā)現,let-7a-5p高表達組5年累積生存率高于低表達組。提示對let-7a-5p水平實時監(jiān)控對C-HCC患者的預后評估有重要意義。

綜上所述,外泌體lncRNA-HEIH和let-7a-5p在C-HCC患者中異常表達,其水平與患者臨床病理特征存在密切關系,二者通過某種調控關系共同參與該疾病的發(fā)生、發(fā)展,及時監(jiān)測lncRNA-HEIH和let-7a-5p水平的變化對患者預后評估有重要意義。但是本研究在實驗設計時,未納入無HCV感染的肝癌患者作為對照進行分析,且研究的樣本量相對較少,在未來將擴大樣本量,考慮增加無HCV感染的肝癌患者,進一步探討lncRNA-HEIH和let-7a-5p與C-HCC的關系,為C-HCC發(fā)生、發(fā)展機制的研究提供可靠依據。