王壯壯 劉彥廷 龔 偉 周 猛 賈文學 艾文兵 田春雷

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，5 年生存率低于6%，中位生存期僅14.6 個月[1]。由于具有復(fù)雜的生物學特性，膠質(zhì)瘤通常需要采取最大可能保留神經(jīng)功能為主的切除術(shù)輔以術(shù)后放化療等綜合治療方案[2]。目前，膠質(zhì)瘤在免疫治療、腫瘤電場治療和分子靶向治療上研究進展迅速，但這些治療方案并沒有為膠質(zhì)瘤病人帶來更大的生存獲益，膠質(zhì)瘤病人的總體預(yù)后仍然相對較差[3]。因此如何突破當前膠質(zhì)瘤特別是膠質(zhì)母細胞瘤治療的困境是研究者亟待解決的關(guān)鍵。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與調(diào)控多種惡性腫瘤生物學行為[4]。lncRNA轉(zhuǎn)移性肺腺癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）位于細胞核散斑，是一種重要的亞細胞核結(jié)構(gòu)[5]，與核散斑相關(guān)蛋白相互作用，通過激活腫瘤細胞內(nèi)異常信號通路或競爭性抑制微小RNA（miRNA）的表達等多種機制來調(diào)控腫瘤細胞的惡性生物學行為[6，7]。本文探討沉默lncRNA MALAT1 表達對膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 生信分析從中國腦膠質(zhì)瘤基因組計劃數(shù)據(jù)庫（Chinese glioma atlas，CGGA；http://www.cgga.org.cn/）下載lncRNA MALAT1的臨床數(shù)據(jù)，使用R軟件分析低級別膠質(zhì)瘤（low grade glioma，LGG）和高級別膠質(zhì)瘤（high grade glioma，HGG）中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達變化；生存曲線比較低表達和高表達lncRNA MALAT1膠質(zhì)瘤的總體生存率（overall survival，OS）。

1.2 細胞實驗

1.2.1細胞的來源 人星形膠質(zhì)細胞（NHA）和膠質(zhì)瘤細胞系（U87、U251、A172、T98G）購于華中科技大學同濟醫(yī)院神經(jīng)病學研究所，保存于液氮罐和-80 ℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR 檢測膠質(zhì)瘤細胞lncRNA MALAT1 的表達 使用Trizol 試劑提取總RNA，用Primescript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。ABI Prism7500型熒光定量PCR儀進行擴增，每孔加入20 μl反應(yīng)體系（2 μl cDNA，10 μl 蛋白酶，0.5 μl 上下游產(chǎn)物，7 μl 滅菌雙蒸水），重復(fù)進行3 次實驗，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。以GAPDH 為 內(nèi) 參（上 游 引 物 序 列 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，下游引物序列5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA- 3'），lncRNA MALAT1 上 游 引 物 序 列 5'- GGACAGGTCAGAGGGTTTC-3'，下游引物序列5'-CTCGTAACTCTTCTCTGTGCC-3'。用2-△△Ct法計算lncRNA MALAT1的相對表達水平。

1.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建與細胞轉(zhuǎn)染 將含lncRNA MALAT1質(zhì)粒的大腸桿菌菌液接種于含氨芐霉素培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)14～16 h 進行擴增。以3 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min 后收集菌液。按照質(zhì)粒提取試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）步驟操作收集質(zhì)粒，保存于-20 ℃。取對數(shù)生長期膠質(zhì)瘤細胞，接種于6孔板，使用不含抗生素的DMEM 培養(yǎng)24 h。每孔依次加入200 μl Buffer 緩沖液、800 ng 質(zhì)粒、4 μl 轉(zhuǎn)染試劑混合液，靜置10 min，均勻轉(zhuǎn)染各孔24 h 后觀察。sh-MALAT1 組轉(zhuǎn)染lncRNA MALAT1 質(zhì)粒，sh-NC轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖 將U87 與A172 細胞接種于96孔板，密度為5×103個/孔，輕輕旋轉(zhuǎn)使細胞均勻分散，37 ℃培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h，向每個孔加入CCK8 試劑約10 μl 孵育2 h。使用酶標儀檢測450 nm波長吸光密度值并制作增殖曲線。每組選4個復(fù)孔。

1.2.5 免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達 收集細胞，采用RIPA細胞裂解液充分裂解，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓設(shè)置為120 V。電泳結(jié)束后，120 V轉(zhuǎn)膜150 min，用5% BSA 封閉PDVF 膜，加入STMN1、RAB5A和ATG4D一抗4 ℃孵育過夜，次日再用PBST緩沖液洗滌3 次，每次5 min，再用GAPDH 標記的二抗孵育2 h，洗滌后滴加EC發(fā)光液顯影，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期的膠質(zhì)瘤細胞系U87、A172細胞離心后棄去上清液，依次加入碘化丙碇和異硫氰酸熒光素各6 μl 混勻，避光培養(yǎng)30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學分析使用R4.0、Graphpad8.0軟件進行分析；計量資料用±s表示，使用t檢驗和方差分析；P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生信分析結(jié)果lncRNAMALAT1 在LGG 和膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma，GBM）中表達量均高于正常組織（P＜0.05；圖1A），且GBM 表達量明顯高于LGG（P＜0.05；圖1A）。lncRNA MALAT1 高表達GBM 病人OS明顯縮短（P＜0.05；圖1B）。

圖1 檢索CGGA數(shù)據(jù)庫分析膠質(zhì)瘤lncRNA MALAT1的表達情況

2.2 細胞實驗結(jié)果

2.2.1 lncRNA MALAT1在膠質(zhì)瘤細胞系中的表達情況 與正常腦星形膠質(zhì)細胞（NHA）相比，U87、A172、U251、T98G 細胞lncRNA MALAT1 相對表達量顯著升高（P＜0.01；圖2），而且，U87 和A172 細胞增高最明顯；因此，使用U87 和A172 細胞系進行后續(xù)細胞實驗。

圖2 膠質(zhì)瘤細胞系lncRNA MALAT1的表達情況

2.2.2 沉默lncRNA MALAT1表達抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖sh-MALAT1組U87和A172細胞增殖活性均明顯低于sh-NC組（P＜0.05；圖3），而且隨時間延長，細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05；圖3）

圖3 沉默lncRNA MALAT1表達抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖

2.2.3 沉默lncRNA MALAT1表達促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡sh-MALAT1組U87和A172細胞凋亡率明顯高于sh-NC組（P＜0.01；圖4）。

圖4 沉默lncRNA MALAT1表達促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡

2.2.4 沉默lncRNA MALAT1 表達抑制STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達TargetScan 軟件分析顯 示STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋 白 為lncRNA MALAT1的下游靶點。CGGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，膠質(zhì)瘤 組 織lncRNA MALAT1 與STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達量呈正相關(guān)（r分別為0.608、0.833、0.737；P＜0.05）。免疫印跡法檢測U87和A172細胞STMN1、RAB5A和ATG4D的表達結(jié)果顯示，sh-MALAT1 組U87 和A172 細 胞STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白表達量明顯高于sh-NC 組（P＜0.05；圖5）。

圖5 沉默lncRNA sh-MALAT1抑制膠質(zhì)瘤細胞STMN1、RAB5A和ATG4D的蛋白表達

3 討論

lncRNA在腫瘤細胞分化、表觀遺傳和細胞分裂周期調(diào)控等多種生命活動中發(fā)揮重要作用[8]。lncRNA MALAT1主要在細胞的核散斑中表達，通過調(diào)節(jié)絲氨酸/精氨酸剪接因子的活性來調(diào)控mRNA的選擇性剪接，促進腫瘤的惡性增殖進程[9]。另外，lncRNA MALAT1可通過誘導m6A 甲基化介導miR-1914-3p表達，促進非小細胞肺癌細胞生長[10]。在胃癌細胞中，lncRNA MALAT1 過表達激活PI3K/AKT信號通路，促進癌細胞異常增殖和遷移[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1 與NEAT1 共同作用于PTBP3，導致P53 失活，調(diào)控肝癌細胞的增殖與侵襲[12]。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織lncRNA MALAT1呈高表達，與病人的不良預(yù)后密切相關(guān)；細胞實驗發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA MALAT1 表達，能夠抑制U87 和A172 細胞增殖，促進凋亡；TargetScan 預(yù)測顯示，lncRNA MALAT1 與STMN1、RAB5A、ATG4D 蛋白可能存在結(jié)合位點，免疫印跡法檢測結(jié)果顯示下調(diào)lncRNA MALAT1 抑制STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達。有研究報道，STMN1、RAB5A 和ATG4D與NF-κB 信號通路的異常激活存在相關(guān)性[13]。lncRNA MALAT1可能通過調(diào)控NF-κB信號通路，上調(diào)STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達，進而對膠質(zhì)瘤細胞的增殖和凋亡等生物學行為產(chǎn)生影響。

總之，膠質(zhì)瘤lncRNA MALAT1 呈高表達，可能通過靶向上調(diào)STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達水平，促進膠質(zhì)瘤細胞增殖、抑制膠質(zhì)瘤細胞凋亡。沉默lncRNA MALAT1 表達明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、促進其凋亡。