史曉麗，鄭德耀，倪建成，黃偉卿,，鐘李強，葉祖云，阮少江

（1.寧德師范學院生命科學學院福建省特色藥用植物工程技術(shù)研究中心，福建 寧德 352100；2.寧德市鼎誠水產(chǎn)有限公司，福建 寧德3 521004）

大黃魚（Larimichthys crocea）主要分布于在我國的黃海南部、東海、臺灣海峽到南海雷州半島以東，是我國最重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，2019 年產(chǎn)量達到22.6 萬t，居于海水養(yǎng)殖魚類之首[1]。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖密度增高、餌料質(zhì)量風險和養(yǎng)殖環(huán)境變化等使得大黃魚養(yǎng)殖病害頻發(fā)，制約了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。開發(fā)增強水產(chǎn)動物抗病能力的環(huán)保型飼料添加劑已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展趨勢[2]。

太子參（Pseudostellaria heterophylla）是一種傳統(tǒng)的中藥材，在臨床上常被用做補虛藥。太子參含有多糖、皂苷、氨基酸、微量元素等活性物質(zhì)，具有抗疲勞、抗氧化、抗炎等多種藥理活性[3-5]。在小鼠和豬的研究中證實，太子參可以增強機體的免疫力[6-8]，但在水產(chǎn)動物中的研究很少。僅吳斌[9]報道了太子參多糖可增強福瑞鯉（FFRC strain common carps）的非特異性免疫功能，提高抗病力；姚勇[10]報道了太子參可以增強對蝦的抗應(yīng)激能力。目前僅見阮少江等[11]和黃偉卿等[12]報道了太子參提取液能顯著提高大黃魚的成活率和生長性能，改善肌肉營養(yǎng)，但是，太子參及其復(fù)方中草藥對大黃魚在分子水平及酶活水平的影響，仍未見報道。

本研究在大黃魚飼料中添加不同濃度的太子參及其復(fù)方中草藥，分析大黃魚體內(nèi)過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）以及谷胱甘肽還原酶（GR）的基因表達變化，為全面分析太子參對大黃魚的影響奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大黃魚來源于寧德市鼎誠水產(chǎn)有限公司自繁的健康大黃魚幼魚，平均體長為（25.28±0.91）cm，體質(zhì)量為（36.14±7.18）g。實驗所用太子參購買于福建寧德拓榮太子參種植專業(yè)合作社，所用黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天、白術(shù)、當歸、茯苓購自于福州承創(chuàng)堂藥店有限公司。太子參提取液的制備參照阮少江等[11]的方法。實驗分為不添加太子參提取液的對照組（C）和5 個實驗組（E1～E5）：E1 組飼料中太子參提取液的添加濃度為0.5%，E2～E5 組飼料中，太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天等中草藥提取液的添加濃度為1%，其中E2 組飼料中，太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天的添加濃度分別為0.167%（總1%）；E3 組飼料中，太子參的添加濃度為0.5%，其余中草藥（同E2 組）的添加濃度分別為0.1%；E4 組飼料中，太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天、白術(shù)、當歸、茯苓的添加濃度分別為0.111%；E5 組飼料中，太子參的添加濃度為0.5%，其余中草藥（同E4 組）的添加濃度分別為0.0625%。

養(yǎng)殖期間，每天投喂2 次，根據(jù)體質(zhì)量變化在1%～2%之間，視攝食情況酌情調(diào)整。養(yǎng)殖水體水溫在24℃～26℃之間，溶解氧量大于5.0 mg/L，氨氮小于0.2 mg/L，pH8.0 左右。養(yǎng)殖30 d 后，每組隨機取3 尾健康個體，活體解剖，分離的腎臟和脾臟保存在液氮中備用。

1.2 總RNA 提取及cDNA 合成

使用Trizol 法提取大黃魚脾臟和腎臟組織的總RNA，具體操作方法參照說明書（Invitrogen，美國）進行。RNA 提取完成后，采用紫外分光光度計檢測RNA 的質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按照PrimeScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix（Takara）試劑盒說明書進行cDNA 第一鏈的合成，總反應(yīng)體系為10 μL。10 μL 反應(yīng)體系包含：5×Buffer 2 μL，Enzyme Mix Ⅰ0.5 μL，OligdT 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，RNA 1 μg，加水補至10 μL。

1.3 基因的組織表達分析

根據(jù)本實驗室測序得到的大黃魚轉(zhuǎn)錄組序列，使用NCBI 在線引物設(shè)計程序設(shè)計了引物，以βactin 作為內(nèi)參基因，采用TB Green 預(yù)混合Ex TaqTM（Takara）試劑盒，用相對熒光定量PCR 檢測GSH、CAT 和GR 基因在不同組織中的表達。反應(yīng)體系如下：12.5 μL TB Green Ex TaqTM（TaKaRa），上下游引物各1 μL（2 μM），稀釋后的cDNA 模板（1∶10 稀釋）2 μL，加水補至25 μL。循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min；95℃15 s，60℃45 s，40 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線。實驗設(shè)置3 個平行，以平均值進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)2-△△Ct方法[13]計算每個基因的相對表達量，所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0 進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），比較均值的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫酶基因的組織表達分析

過氧化氫酶基因在大黃魚腎臟和脾臟組織中的相對表達量見圖1。腎臟組織中，除E2 組外，該基因在各實驗組中均下調(diào)表達，尤其是E5 組，表達量僅為對照組的0.28 倍。E2 組中，該基因的表達量最高，為對照組的1.4 倍（P＞0.05）。脾臟組織中，該基因在各實驗組中均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)表達，尤其是E1 組，表達量僅為對照組的0.41 倍。

圖1 飼料添加太子參對大黃魚過氧化氫酶基因表達的影響Fig.1 The expression profiles of CAT mRNA in large yellow croaker L.crocea in each group

2.2 谷胱甘肽過氧化物酶基因的組織表達分析

谷胱甘肽過氧化物酶基因在大黃魚腎臟和脾臟組織中的相對表達量見圖2。在腎臟組織中，除E5 組外，該基因在各實驗組中均下調(diào)表達，尤其是E3 組，表達量僅為對照組的0.57 倍（P＞0.05）。E5組中，該基因的表達量最高，為對照組的1.15 倍。脾臟中，該基因在E3 和E5 組中上調(diào)表達，表達量分別為對照組的1.4 和1.13 倍，其余組中下調(diào)表達，尤其是E1 組下降的最多，表達量僅為對照組的0.65 倍（P＞0.05）。

圖2 飼料添加太子參對大黃魚谷胱甘肽過氧化物酶基因表達的影響Fig.2 The expression profiles of GPx mRNA in large yellow croaker L.crocea in each group

2.3 谷胱甘肽還原酶基因的組織表達分析

谷胱甘肽還原酶基因在大黃魚腎臟和脾臟組織中的相對表達量見圖3。腎臟組織中，該基因在各實驗組中均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)表達，尤其是E2組和E3 組的表達量僅為對照組的0.28 倍。脾臟組織中的表達情況和腎臟中類似，均下調(diào)表達，其中E2 組和E3 組中該基因的表達量分別為對照組的0.55 和0.50 倍（P＞0.05）。

圖3 飼料添加太子參對大黃魚谷胱甘肽還原酶基因表達的影響Fig.3 The expression profiles of GR mRNA in Large yellow croaker L.crocea in each group

表1 引物序列及信息Tab.1 Primer sequences in qRT-PCR

3 討論

本研究率先報道了飼料添加太子參等復(fù)方中草藥對大黃魚CAT、GPx 和GR 幾種抗氧化酶基因表達的影響，為深入了解太子參對大黃魚非特異性免疫的影響奠定了基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

前期本課題組發(fā)現(xiàn)，大黃魚飼料中添加不同濃度的太子參明顯影響了大黃魚的體質(zhì)量，且隨養(yǎng)殖時間的延長，體質(zhì)量的絕對增加率均顯著高于對照組（P＜0.05）。攻毒實驗也表明，實驗組大黃魚的死亡率明顯下降（P＜0.05），這說明太子參可以在一定程度上提高其免疫力[11]。本課題組還發(fā)現(xiàn)，實驗組大黃魚體內(nèi)的細胞吞噬活性、血清SOD、CAT 等的酶活性也表現(xiàn)出了不同水平的上升（尚未發(fā)表）。但是，在本研究中，飼料中添加太子參等中草藥后，飼喂30 d 時，腎臟和脾臟組織中的CAT、GSH、GR 的基因出現(xiàn)了下調(diào)表達，推測可能是因為中草藥的藥性較慢所致。

CAT、GPx 和GR 都是抗氧化相關(guān)的酶類。過氧化氫酶在機體的抗氧化防御中占有非常重要的地位。該酶和SOD 共同參與了機體內(nèi)多余H2O2的清除過程。在亞東鮭（Salmo trutta fario）[14]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[15]、吉富羅非魚（GIFT,Oreochromis niloticus）[16]等魚類飼料中添加大黃、黃芪、連翹、黃苓等復(fù)方中草藥可以在一定程度上促進魚類的抗氧化能力，但是隨著添加量及養(yǎng)殖時間的差異，這種提高并不一定是100%。前期研究中發(fā)現(xiàn)，大黃魚在食用添加太子參提取液的飼料之后，隨著飼喂時間的延長（15～120 d），各實驗組血液中CAT的酶活性表現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，30 d 和120 d 時，飼料添加0.5%太子參的實驗組中，血液中CAT 的酶活性顯著低于對照組（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。本研究中，實驗組1 的太子參添加劑量為0.5%，腎臟和脾臟組織中的CAT 的基因表達也下調(diào)，和本課題組之前的研究結(jié)果類似。谷胱甘肽還原酶也是一種重要的抗氧化酶，在生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。它可以催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為還原型谷胱甘肽（GSH），進而維持細胞中GSSG 和GSH 的動態(tài)平衡[17]。GR 主要分布在線粒體及胞漿中，而CAT 主要分布在過氧化物酶體內(nèi)，所以GR比CAT 的分布更廣泛，也是生物體內(nèi)清除H2O2的最主要途徑。

GPx 是一類廣泛存在于需氧生物體內(nèi)的重要抗氧化酶，它與SOD 和CAT 共同組成了生物體內(nèi)重要的抗氧化還原系統(tǒng)，防止細胞膜和其他生物組織功能受到氧化應(yīng)激的損傷[18]。魚類中關(guān)于該酶的研究報道比較多，如斑馬魚（Danio rerio）、羅非魚、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、虹鱒[19-23]等。這些研究多側(cè)重于其基因結(jié)構(gòu)和活性檢測，且都集中在生態(tài)毒理學方面。斑馬魚在甲基汞脅迫下，GPx1a 和GPx1b 的mRNA 和酶活均下調(diào)表達[24]；（Gobio gobio）在3,3,4,4,-四氯聯(lián)苯的脅迫下，肝臟中的GPx1 的mRNA 下調(diào)表達，但其GPx 酶活并無顯著變化[25]。研究發(fā)現(xiàn)，饑餓條件下大黃魚GPx 的mRNA 表達和酶活均出現(xiàn)上升的趨勢；而在鋅離子脅迫下，GPxla 和GPxlb 的mRNA 均下調(diào)表達，酶活性則上調(diào)表達[17]。在病原菌侵染下，謝曉澤[18]發(fā)現(xiàn)大黃魚脾臟中的GPx 基因在感染副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）后的96 h 內(nèi)呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，而腎臟中的表達趨勢并不顯著，僅在感染后24 h 和72 h 出現(xiàn)了上調(diào)表達的趨勢。溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）脅迫下，大黃魚體內(nèi)SOD 基因在肝臟中也呈現(xiàn)出上調(diào)表達趨勢[26]。魚類的腎臟和脾臟作為主要的免疫器官和造血部位，GPx、CAT、SOD 等抗氧化相關(guān)酶的上調(diào)表達有助于消除在血液循環(huán)過程中過量產(chǎn)生的H2O2，進而防止細胞損傷，尤其是環(huán)境條件不良或者外界病原刺激的條件下[26-28]。但是在餌料添加中草藥后，這些抗氧化相關(guān)基因的表達是什么樣子的，迄今為止并沒有很多的研究。

中草藥作為免疫添加劑應(yīng)用在水產(chǎn)動物防治上，是新型漁藥開發(fā)的一個重要方向。將大黃、黨參等中草藥投喂大黃魚，大多數(shù)的非特異性免疫指標會隨著飼喂時間的延長表現(xiàn)出一定的變化，如李梅芳等人發(fā)現(xiàn)，大黃魚在投喂了中草藥后的28 d 內(nèi)，其血液中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的酶活均隨飼料投喂時間的延長而表現(xiàn)出先升后降的趨勢，可以提高大黃魚的非特異性免疫活性[29]。這和鯉（Cyprinus carpio）[30]、羅非魚[31]、黃鱔（Monopterus albus）[32]等的研究結(jié)果類似。中草藥的成分復(fù)雜，作用廣泛，目前將中草藥作為飼料添加劑的研究多數(shù)集中在使用效果上，不能解釋藥物的作用機理。雖然很多中草藥的主要化學成分及其作用機理已研究清楚，但是多種中草藥配伍后，化學藥物成分更復(fù)雜，再加上不同的化學藥物成分之間會發(fā)生各種化學和物理變化，即便是同種藥物，炮制方法不同，化學成分、藥性也會發(fā)生相應(yīng)的變化[33]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，各添加組在實驗30 d 的時，腎臟和脾臟中的三種氧化酶的基因表達基本是下調(diào)表達，只有少數(shù)幾個組中CAT 和GPx 出現(xiàn)了上調(diào)表達，推測可能是由于養(yǎng)殖時間不夠長導致。鑒于本課題組只做了30 d 的對比，還需要進一步通過細菌感染實驗去綜合分析這些基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的變化。

總之，本研究率先在大黃魚的飼料中添加太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天等中草藥，從基因表達層面分析了幾種抗氧化酶的變化，為深入了解中草藥對大黃魚的影響奠定了理論基礎(chǔ)。雖然本實驗發(fā)現(xiàn)幾種氧化酶的基因表達受到了抑制，但是不可否認中草藥添加作為一種更高效和安全的養(yǎng)殖手段，在改善機體免疫狀態(tài)，提高機體自身的抗病能力上有很大的應(yīng)用前景，符合“無抗化”養(yǎng)殖的趨勢。