江林燕 王向迎 韓利娜

肺癌是全球最常見的癌癥之一[1],相當多的肺癌患者被確診時已處于晚期,晚期患者的5年生存率約為15%[2]。早期檢測肺癌的方法有侵入性和非侵入性的,包括熒光支氣管鏡檢查、痰細胞學檢查和胸部X線檢查[3],但是,特異性或敏感性較低。目前,使用血液,尿液和唾液等體液進行生物標志物檢測已成為癌癥診斷和治療監(jiān)測的一種有前途的方法,這主要是因為其侵入性最小且易于獲取[4]。目前發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的生物大分子可作為肺癌的生物標志物[5]。BALF是在常規(guī)的柔性支氣管鏡檢查期間收集的,已被廣泛接受為一種安全且微創(chuàng)的方法[6]。BALF的優(yōu)點在于它可以提供多種信息,包括發(fā)生在肺實質(zhì)中的免疫、炎癥和感染過程[7]。Uribarri M等[8]通過二維電泳后質(zhì)譜分析鑒定了非小細胞肺癌支氣管肺泡灌洗液中的潛在標志物:載脂蛋白A1(Apolipoprotein A1,APOA1)、補體成分4A (Complement Component 4A,CO4A)、C反應蛋白(C-Reactive Protein,CRP)。然而,除了二維電泳方法復雜繁瑣外,這些潛在標志物并未在臨床中進行驗證和分析其診斷價值?；诖?本研究將支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP單項診斷效能進行比較,旨在探討聯(lián)合診斷對非小細胞肺癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入2017年8月至2020年8月我院收治的非小細胞肺癌患者92例為癌癥組,其中男性62例、女性30例,平均年齡(54.35±16.43)歲。所有患者先前均已通過對從原發(fā)灶獲取的活檢樣品進行組織病理學分析而診斷為非小細胞肺癌,并依據(jù)肺薄層CT影像學記錄腫瘤最大直徑。排除標準:①嚴重心、肝、腎功能損害者;②服用過內(nèi)分泌藥物者;③患有其他腫瘤者;④患有精神疾病者;⑤進行過相關(guān)治療者。納入肺炎患者30例為肺炎組,其中男性15例,女性15例,平均年齡(52.45±12.42)歲。納入支氣管炎患者30例為支氣管炎組,其中男性14例,女性16例,平均年齡(53.55±13.35)歲。納入肺結(jié)節(jié)患者30例為肺結(jié)節(jié)組,其中男性17例,女性13例,平均年齡(54.96±15.37)歲。同時,納入2017年8月至2020年8月至我院進行體檢的健康志愿者92例為對照組,其中男性56例,女性36例,平均年齡(57.32±17.12)歲。良性組和對照組合并為非癌癥組。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),可納入此次分析。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批,受試者均簽署知情同意書。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗

從5組受試人員的節(jié)段性支氣管中收集20 ml支氣管肺泡灌洗液,在4 ℃下以500 g離心5 min以除去碎屑,使用Amicon過濾器以5000 g在4 ℃下濃縮60 min,使用0.5 mL 3 kDa Amicon過濾器濃縮蛋白質(zhì)樣。通過Bradford測定法測量每種BAL的總蛋白濃度,將所有樣品的蛋白濃度歸一化為5 μg/μL。采取5組受試人員肘前靜脈血5 ml,在4 ℃靜止過夜后以500 g離心5 min取上清為血清。APOA1 ELISA試劑盒購自北京欣博盛生物科技有限公司(貨號:EHC121.96.2)。CO4A ELISA試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司(貨號:ADI-900-059)。CRP ELISA試劑盒購自廣州威佳科技有限公司(貨號:ELH-CRP-2(2x96T))。CA125 ELISA試劑盒購自上海群己生物科技有限公司(貨號:KA0205)。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用Python中pandas package進行統(tǒng)計學分析。陽性臨界值為ROC曲線中靈敏度-(1-特異度)的最大值所對應的數(shù)值?；加蟹切〖毎伟┑臑檎骊栃?未患有非小細胞肺癌的為真陰性。三者滿足其一者為聯(lián)合診斷陽性,反之則為聯(lián)合診斷陰性。使用one-way ANOVA檢驗檢測5組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP表達水平的差異性。應用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP檢測非小細胞肺癌的臨床診斷價值。Pearson相關(guān)系數(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP與腫瘤直徑大小的相關(guān)性。P<0.05的差異被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 5組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達水平

癌癥組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達水平均高于肺炎組、支氣管炎組、肺結(jié)節(jié)組和對照組受試人員(P<0.05),肺炎組、支氣管炎和肺結(jié)節(jié)組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達水平均高于對照組受試人員(P<0.05)。肺炎組、支氣管炎和肺結(jié)節(jié)組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達水平無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 5組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達水平

2.2 癌癥組和非癌癥組支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值

為了評估支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125對非小細胞肺癌的診斷價值,繪制相關(guān)ROC曲線(圖1)。APOA1的陽性臨界值128.5(ng/ml)時診斷靈敏度為91.05%,特異度為91.14%;CO4A的陽性臨界值20.97(ng/ml)時診斷靈敏度為90.35%,特異度為91.22%;CRP的陽性臨界值90.51(ng/ml)時診斷靈敏度為92.45%,特異度為93.06%。見圖1和表2。以APOA1、CO4A、CRP的陽性臨界值為診斷標準進行聯(lián)合診斷。支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP聯(lián)合對非小細胞肺癌的診斷的靈敏度為98.91%,特異度為90.22%,準確性為93.12%。CA125的陽性臨界值11.51(U/ml)時診斷靈敏度為83.04%,特異度為85.24%。

圖1 癌癥組和非癌癥組支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的ROC曲線

表2 癌癥組和非癌癥組支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

2.3 支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達水平與非小細胞肺癌腫瘤大小的相關(guān)性

支氣管肺泡灌洗液中APOA1的表達水平與非小細胞肺癌腫瘤大小的相關(guān)系數(shù)為0.314(P<0.05);支氣管肺泡灌洗液中CO4A的表達水平與非小細胞肺癌大小的相關(guān)系數(shù)為0.225(P<0.05);支氣管肺泡灌洗液中CRP的表達水平與非小細胞肺癌大小的相關(guān)系數(shù)為0.284(P<0.05)。見圖2。

圖2 支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達水平與非小細胞肺癌大小的相關(guān)性

3 討論

肺癌仍然是世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的死亡的最常見原因[9]。NSCLC通常通過外科手術(shù)治療,而SCLC通常對化學療法和放射療法的反應更好[10]。但是,傳統(tǒng)療法的臨床結(jié)果仍然很差(5年生存率為15%),這主要是由于難以早期診斷。本研究通過ELISA檢測,發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP聯(lián)合檢測對非小細胞肺癌的診斷的靈敏度為98.91%,特異度為90.22%,準確性為93.12%。

支氣管鏡檢查可被視為疑似肺癌患者的主要診斷方法,也是選擇適當治療策略的必要方法[11]。盡管其他組織采購方法具有較小的侵入性,但并發(fā)癥風險小且特異性高,盡管它的敏感性相對較差。預計不需要收集腫瘤細胞的方法,例如支氣管液中分子標記的檢測,將提高細胞學檢查的敏感性和診斷準確性[12]。傳統(tǒng)上,血液一直是用于非侵入性生物標志物分析的生物流體,但是在這種復雜混合物中檢測低豐度腫瘤蛋白可能非常具有挑戰(zhàn)性。與活檢相比,支氣管肺泡灌洗代表著更特異性的肺癌生物標志物的替代來源,因為它靠近腫瘤細胞,其蛋白質(zhì)組成較不復雜,并且可以通過微創(chuàng)方法獲得[13]。因此,相比于傳統(tǒng)方法,支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達水平檢測對于診斷非小細胞肺癌具有高靈敏性和高特異性。

在本研究中,癌癥組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達水平均高于肺炎組、支氣管炎組、肺結(jié)節(jié)組和對照組受試人員(P<0.05),肺炎組、支氣管炎和肺結(jié)節(jié)組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達水平均高于對照組受試人員(P<0.05)。CO4A是經(jīng)典激活途徑的一部分。補體系統(tǒng)既參與先天免疫,也參與適應性免疫,是機體免疫系統(tǒng)的一個非常重要的部分[14]。CRP通過與血液中的體液和細胞效應系統(tǒng)相互作用來識別宿主的外來病原體和受損細胞,并啟動其清除,從而參與多種宿主防御相關(guān)功能[15]。目前,已有文獻報道肺癌患者中CRP和CO4A補體因子過表達。提示慢性活動性炎癥狀態(tài)和免疫應答異常是非小細胞肺癌的標志之一。APOA1調(diào)節(jié)高密度脂蛋白的形成和脂蛋白脂肪酶的活性[16],提示血脂異常和代謝紊亂可能與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。肥胖、脂質(zhì)和非小細胞肺癌風險之間的關(guān)系已經(jīng)得到了大量的科學統(tǒng)計分析,肥胖可能是肺癌發(fā)生的一個預防因素。提示APOA1表達量的提高可能是機體為了抵抗非小細胞肺癌而啟動的一種防御機制。

然而,本研究存在一些局限性。首先,患者人數(shù)相對較少,這導致了小組人數(shù)的減少,需要對更多患者進行進一步研究以證實我們的發(fā)現(xiàn)。其次,本研究沒有考慮與肺部病原體感染的可能性。此外,多項研究發(fā)現(xiàn)肺癌與吸煙習慣有關(guān)[17],但是本研究尚未將患者是否吸煙進行分組。

綜上所述,支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達水平可作為非小細胞肺癌的潛在標志。