江林燕 王向迎 韓利娜

肺癌是全球最常見的癌癥之一[1],相當(dāng)多的肺癌患者被確診時已處于晚期,晚期患者的5年生存率約為15%[2]。早期檢測肺癌的方法有侵入性和非侵入性的,包括熒光支氣管鏡檢查、痰細(xì)胞學(xué)檢查和胸部X線檢查[3],但是,特異性或敏感性較低。目前,使用血液,尿液和唾液等體液進行生物標(biāo)志物檢測已成為癌癥診斷和治療監(jiān)測的一種有前途的方法,這主要是因為其侵入性最小且易于獲取[4]。目前發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的生物大分子可作為肺癌的生物標(biāo)志物[5]。BALF是在常規(guī)的柔性支氣管鏡檢查期間收集的,已被廣泛接受為一種安全且微創(chuàng)的方法[6]。BALF的優(yōu)點在于它可以提供多種信息,包括發(fā)生在肺實質(zhì)中的免疫、炎癥和感染過程[7]。Uribarri M等[8]通過二維電泳后質(zhì)譜分析鑒定了非小細(xì)胞肺癌支氣管肺泡灌洗液中的潛在標(biāo)志物:載脂蛋白A1(Apolipoprotein A1,APOA1)、補體成分4A (Complement Component 4A,CO4A)、C反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein,CRP)。然而,除了二維電泳方法復(fù)雜繁瑣外,這些潛在標(biāo)志物并未在臨床中進行驗證和分析其診斷價值?；诖?本研究將支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP單項診斷效能進行比較,旨在探討聯(lián)合診斷對非小細(xì)胞肺癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入2017年8月至2020年8月我院收治的非小細(xì)胞肺癌患者92例為癌癥組,其中男性62例、女性30例,平均年齡(54.35±16.43)歲。所有患者先前均已通過對從原發(fā)灶獲取的活檢樣品進行組織病理學(xué)分析而診斷為非小細(xì)胞肺癌,并依據(jù)肺薄層CT影像學(xué)記錄腫瘤最大直徑。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者;②服用過內(nèi)分泌藥物者;③患有其他腫瘤者;④患有精神疾病者;⑤進行過相關(guān)治療者。納入肺炎患者30例為肺炎組,其中男性15例,女性15例,平均年齡(52.45±12.42)歲。納入支氣管炎患者30例為支氣管炎組,其中男性14例,女性16例,平均年齡(53.55±13.35)歲。納入肺結(jié)節(jié)患者30例為肺結(jié)節(jié)組,其中男性17例,女性13例,平均年齡(54.96±15.37)歲。同時,納入2017年8月至2020年8月至我院進行體檢的健康志愿者92例為對照組,其中男性56例,女性36例,平均年齡(57.32±17.12)歲。良性組和對照組合并為非癌癥組。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),可納入此次分析。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批,受試者均簽署知情同意書。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗

從5組受試人員的節(jié)段性支氣管中收集20 ml支氣管肺泡灌洗液,在4 ℃下以500 g離心5 min以除去碎屑,使用Amicon過濾器以5000 g在4 ℃下濃縮60 min,使用0.5 mL 3 kDa Amicon過濾器濃縮蛋白質(zhì)樣。通過Bradford測定法測量每種BAL的總蛋白濃度,將所有樣品的蛋白濃度歸一化為5 μg/μL。采取5組受試人員肘前靜脈血5 ml,在4 ℃靜止過夜后以500 g離心5 min取上清為血清。APOA1 ELISA試劑盒購自北京欣博盛生物科技有限公司(貨號:EHC121.96.2)。CO4A ELISA試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司(貨號:ADI-900-059)。CRP ELISA試劑盒購自廣州威佳科技有限公司(貨號:ELH-CRP-2(2x96T))。CA125 ELISA試劑盒購自上海群己生物科技有限公司(貨號:KA0205)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Python中pandas package進行統(tǒng)計學(xué)分析。陽性臨界值為ROC曲線中靈敏度-(1-特異度)的最大值所對應(yīng)的數(shù)值?；加蟹切〖?xì)胞肺癌的為真陽性,未患有非小細(xì)胞肺癌的為真陰性。三者滿足其一者為聯(lián)合診斷陽性,反之則為聯(lián)合診斷陰性。使用one-way ANOVA檢驗檢測5組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP表達(dá)水平的差異性。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP檢測非小細(xì)胞肺癌的臨床診斷價值。Pearson相關(guān)系數(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP與腫瘤直徑大小的相關(guān)性。P<0.05的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達(dá)水平

癌癥組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達(dá)水平均高于肺炎組、支氣管炎組、肺結(jié)節(jié)組和對照組受試人員(P<0.05),肺炎組、支氣管炎和肺結(jié)節(jié)組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達(dá)水平均高于對照組受試人員(P<0.05)。肺炎組、支氣管炎和肺結(jié)節(jié)組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 5組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達(dá)水平

2.2 癌癥組和非癌癥組支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值

為了評估支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125對非小細(xì)胞肺癌的診斷價值,繪制相關(guān)ROC曲線(圖1)。APOA1的陽性臨界值128.5(ng/ml)時診斷靈敏度為91.05%,特異度為91.14%;CO4A的陽性臨界值20.97(ng/ml)時診斷靈敏度為90.35%,特異度為91.22%;CRP的陽性臨界值90.51(ng/ml)時診斷靈敏度為92.45%,特異度為93.06%。見圖1和表2。以APOA1、CO4A、CRP的陽性臨界值為診斷標(biāo)準(zhǔn)進行聯(lián)合診斷。支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP聯(lián)合對非小細(xì)胞肺癌的診斷的靈敏度為98.91%,特異度為90.22%,準(zhǔn)確性為93.12%。CA125的陽性臨界值11.51(U/ml)時診斷靈敏度為83.04%,特異度為85.24%。

圖1 癌癥組和非癌癥組支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的ROC曲線

表2 癌癥組和非癌癥組支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

2.3 支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌腫瘤大小的相關(guān)性

支氣管肺泡灌洗液中APOA1的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌腫瘤大小的相關(guān)系數(shù)為0.314(P<0.05);支氣管肺泡灌洗液中CO4A的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌大小的相關(guān)系數(shù)為0.225(P<0.05);支氣管肺泡灌洗液中CRP的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌大小的相關(guān)系數(shù)為0.284(P<0.05)。見圖2。

圖2 支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌大小的相關(guān)性

3 討論

肺癌仍然是世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的死亡的最常見原因[9]。NSCLC通常通過外科手術(shù)治療,而SCLC通常對化學(xué)療法和放射療法的反應(yīng)更好[10]。但是,傳統(tǒng)療法的臨床結(jié)果仍然很差(5年生存率為15%),這主要是由于難以早期診斷。本研究通過ELISA檢測,發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP聯(lián)合檢測對非小細(xì)胞肺癌的診斷的靈敏度為98.91%,特異度為90.22%,準(zhǔn)確性為93.12%。

支氣管鏡檢查可被視為疑似肺癌患者的主要診斷方法,也是選擇適當(dāng)治療策略的必要方法[11]。盡管其他組織采購方法具有較小的侵入性,但并發(fā)癥風(fēng)險小且特異性高,盡管它的敏感性相對較差。預(yù)計不需要收集腫瘤細(xì)胞的方法,例如支氣管液中分子標(biāo)記的檢測,將提高細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性和診斷準(zhǔn)確性[12]。傳統(tǒng)上,血液一直是用于非侵入性生物標(biāo)志物分析的生物流體,但是在這種復(fù)雜混合物中檢測低豐度腫瘤蛋白可能非常具有挑戰(zhàn)性。與活檢相比,支氣管肺泡灌洗代表著更特異性的肺癌生物標(biāo)志物的替代來源,因為它靠近腫瘤細(xì)胞,其蛋白質(zhì)組成較不復(fù)雜,并且可以通過微創(chuàng)方法獲得[13]。因此,相比于傳統(tǒng)方法,支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達(dá)水平檢測對于診斷非小細(xì)胞肺癌具有高靈敏性和高特異性。

在本研究中,癌癥組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達(dá)水平均高于肺炎組、支氣管炎組、肺結(jié)節(jié)組和對照組受試人員(P<0.05),肺炎組、支氣管炎和肺結(jié)節(jié)組受試人員支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表達(dá)水平均高于對照組受試人員(P<0.05)。CO4A是經(jīng)典激活途徑的一部分。補體系統(tǒng)既參與先天免疫,也參與適應(yīng)性免疫,是機體免疫系統(tǒng)的一個非常重要的部分[14]。CRP通過與血液中的體液和細(xì)胞效應(yīng)系統(tǒng)相互作用來識別宿主的外來病原體和受損細(xì)胞,并啟動其清除,從而參與多種宿主防御相關(guān)功能[15]。目前,已有文獻(xiàn)報道肺癌患者中CRP和CO4A補體因子過表達(dá)。提示慢性活動性炎癥狀態(tài)和免疫應(yīng)答異常是非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志之一。APOA1調(diào)節(jié)高密度脂蛋白的形成和脂蛋白脂肪酶的活性[16],提示血脂異常和代謝紊亂可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。肥胖、脂質(zhì)和非小細(xì)胞肺癌風(fēng)險之間的關(guān)系已經(jīng)得到了大量的科學(xué)統(tǒng)計分析,肥胖可能是肺癌發(fā)生的一個預(yù)防因素。提示APOA1表達(dá)量的提高可能是機體為了抵抗非小細(xì)胞肺癌而啟動的一種防御機制。

然而,本研究存在一些局限性。首先,患者人數(shù)相對較少,這導(dǎo)致了小組人數(shù)的減少,需要對更多患者進行進一步研究以證實我們的發(fā)現(xiàn)。其次,本研究沒有考慮與肺部病原體感染的可能性。此外,多項研究發(fā)現(xiàn)肺癌與吸煙習(xí)慣有關(guān)[17],但是本研究尚未將患者是否吸煙進行分組。

綜上所述,支氣管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表達(dá)水平可作為非小細(xì)胞肺癌的潛在標(biāo)志。