張苗苗 田君娜 孫穎穎

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因,是全球和中國(guó)最常見的癌癥,導(dǎo)致 2015 年超過 280 萬(wàn)人死亡,其中約 40% 涉及肺腺癌 (ADCs)[1]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),包括ADC和鱗狀細(xì)胞癌(SCC),分別占所有肺癌病例的80%～85%[2]。microRNA (miRNA) 通過降解或抑制靶 mRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)在肺腺癌發(fā)展和進(jìn)展中具有重要作用[3]。此外,現(xiàn)在已知許多 miRNA與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展密切相關(guān)[4]。因此,在了解肺腺癌的分子機(jī)制以識(shí)別新的預(yù)后分子標(biāo)志物方面面臨著巨大的挑戰(zhàn),這些標(biāo)志物可以促進(jìn)在肺癌發(fā)展早期制定適當(dāng)?shù)闹委煵呗?。?xì)胞代謝的重編程,包括凋亡和壞死細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié),是腫瘤發(fā)生所必需的[5]。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的非凋亡性細(xì)胞死亡模式,涉及代謝功能障礙,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝過程谷氨酰胺分解和鐵依賴性活性氧 (ROS)、鐵載體蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白和線粒體超氧化物的產(chǎn)生,以及膜電位減少和其他相關(guān)調(diào)節(jié)劑的形成[6]。鐵死亡水平異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。基于此,本研究通過miRNA微陣列和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析肺腺癌組織和癌旁組織中的差異miRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞Calu-3鐵死亡水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

納入2019年1月至2021年12月我院收治的肺腺癌患者126例,其中男性75例,女性51例,平均年齡(51.23±22.59)歲。所有患者均經(jīng)過我院病理科診斷并確診為肺腺癌,并且均簽署知情同意書且本研究獲得我院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集患者治療前的肺腺癌組織和癌旁組織后保存于液氮中。

miRvana總RNA分離試劑盒購(gòu)自艾德科技公司(貨號(hào):AM1561)。GAPDH、STK11、KEAP1抗體購(gòu)自abcam公司(貨號(hào):ab8245、ab15095、ab227828)。本研究所有的siRNA、miR-627-3p mimics、miR-627-3p inhibitor、STK11和KEAP1過表達(dá)質(zhì)粒均由北京睿博設(shè)計(jì)合成。人肺腺癌細(xì)胞Calu-3購(gòu)自廣州群賢科技有限公司(貨號(hào):CTCC-003-0104)。PrimeScript RT Master Mix Kit購(gòu)自廣州翔博生物科技有限公司(貨號(hào):RR036A)。DCFH-DA購(gòu)自北京依珊匯通科技有限公司(貨號(hào):D837204-50mg)。C11-BODIPY自深圳市益百順科技有限公司(貨號(hào):GC40165-1mg)。pMIR-REPORT購(gòu)自深圳市益百順科技有限公司(貨號(hào):P0471)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人肺腺癌細(xì)胞Calu-3在添加10% FBS的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng),并將其置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用miRvana總RNA分離試劑盒分離總RNA,并根據(jù)制造商的說明使用NanoDrop分光光度計(jì)進(jìn)行定量。然后將樣品儲(chǔ)存在-80 ℃直至使用。使用PrimeScript RT Master Mix Ki合成cDNA。采用Stem-Loop RT-PCR測(cè)定法檢測(cè)miR-627-3p的表達(dá)。簡(jiǎn)而言之,使用實(shí)時(shí)PCR通用試劑和MX3000P實(shí)時(shí)PCR儀器根據(jù)制造商的說明進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。PCR方案需要35個(gè)循環(huán),即94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min和72 ℃ 1 min,然后在72 ℃延伸5 min。 將細(xì)胞和組織中的RNA水平標(biāo)準(zhǔn)化為U6 snRNA或GAPDH的水平。

1.2.3 MiRNA微陣列分析 使用安捷miRNA微陣列分析服務(wù)從三份肺腺癌組織和癌旁組織中檢測(cè)miRNA表達(dá)譜。

1.2.4 細(xì)胞增殖水平的測(cè)定 MTT法檢測(cè)Calu-3細(xì)胞的增殖水平。用miR-627-3p mimics或inhibitor轉(zhuǎn)染24 h后,將細(xì)胞以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。將10 μL等分的MTT添加到每個(gè)孔中并孵育2 h,然后使用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的光密度。

1.2.5 細(xì)胞鐵死亡水平的測(cè)定 Lipid-ROS水平為鐵死亡指標(biāo)之一。不同處理后,將Calu-3細(xì)胞與10 μM DCFH-DA或5 μM C11-BODIPY無血清培養(yǎng)基中于37 ℃孵育30 min。然后用PBS洗滌細(xì)胞。使用用于DCFH-DA熒光素檢測(cè)的519 nm濾光片和用于C11-BODIPY檢測(cè)的617 nm濾光片在流式細(xì)胞儀上分析ROS水平。

1.2.6 免疫印跡 為了評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá),在裂解緩沖液中從 1×106個(gè)Calu-3細(xì)胞樣品制備全細(xì)胞裂解物,然后在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離含有60 μg蛋白質(zhì)的等分試樣并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜。然后在室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉膜1小時(shí),并在4 ℃下與GAPDH抗體或STK11抗體或KEAP1抗體孵育過夜。隨后,將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1小時(shí)。然后使用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) PCR擴(kuò)增STK11或KEAP1 3'-UTR并克隆到pMIR-REPORTTM載體中。使用Lipofectamine 2000將50 ng pluc-3'UTR(WT 或 MT)、10 ng海腎螢光素酶、5 pmol miR-627-3p mimics和陰性對(duì)照的混合物共轉(zhuǎn)染到Calu-3細(xì)胞中。48 h后,使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)分析熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究使用R軟件(版本:4.1.5)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)檢查組間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。對(duì)于多重比較,使用單因素方差分析,然后進(jìn)行 LSD 事后檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織中miR-627-3p高表達(dá)患者的生存情況

將126例患者的肺腺癌組織和癌旁組織各取33份混合在一起,隨后進(jìn)行miRNA微陣列分析,發(fā)現(xiàn)有27種miRNA變化顯著,其中14種miRNA在肺腺癌組織中表達(dá)下調(diào),13種miRNA在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。按照miRNA在肺腺癌組織中的平均表達(dá)水平,將126例患者分為miRNA低表達(dá)組和miRNA高表達(dá)組。發(fā)現(xiàn)miR-627-3p高表達(dá)的肺腺癌患者生存率優(yōu)于miR-627-3p低表達(dá)的肺腺癌患者(P<0.05),見圖1。

圖1 肺腺癌組織中miR-627-3p表達(dá)患者總生存期

2.2 miR-627-3p調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的鐵死亡

過表達(dá)miR-627-3p后,肺腺癌細(xì)胞Calu-3的細(xì)胞增殖水平下降(P<0.05),鐵死亡水平上升(P<0.05);敲低miR-627-3p后,肺腺癌細(xì)胞Calu-3的細(xì)胞增殖水平上升(P<0.05),鐵死亡水平下降(P<0.05),見圖2。

圖2 miR-627-3p調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的鐵死亡

2.3 miR-627-3p并發(fā)靶向STK11/KEAP1發(fā)揮生物學(xué)功能

使用miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-627-3p發(fā)揮生物學(xué)功能的潛在底物,選取評(píng)分最高的60個(gè)基因進(jìn)行siRNA敲低篩選。敲低STK11或KEAP1時(shí)肺腺癌細(xì)胞Calu-3的細(xì)胞增殖水平下降(P<0.05)、鐵死亡水平上升(P<0.05);過表達(dá)STK11或KEAP1時(shí)肺腺癌細(xì)胞Calu-3的細(xì)胞增殖水平上升(P<0.05)、鐵死亡水平下降(P<0.05),見圖3A～圖3C。預(yù)測(cè)STK11或KEAP1的miR-627-3p結(jié)合位點(diǎn)均位于3'端非翻譯區(qū)。過表達(dá)miR-627-3p后,肺腺癌細(xì)胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平下降;敲低miR-627-3p后,肺腺癌細(xì)胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平上升,見圖3D～圖3F。將預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)突變后,miR-627-3p無法結(jié)合STK11或KEAP1的3'端非翻譯區(qū),見圖3G。

圖3 miR-627-3p并發(fā)靶向STK11/KEAP1發(fā)揮生物學(xué)功能

3 討論

肺腺癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的主要原因,在過去幾十年中發(fā)病率穩(wěn)步上升[8]。因此,在了解肺腺癌的分子機(jī)制以識(shí)別新的預(yù)后分子標(biāo)志物方面面臨著巨大的挑戰(zhàn),這些標(biāo)志物可以促進(jìn)在肺癌發(fā)展早期制定適當(dāng)?shù)闹委煵呗浴１狙芯堪l(fā)現(xiàn)miR-627-3p高表達(dá)的肺腺癌患者生存率優(yōu)于miR-627-3p低表達(dá)的肺腺癌患者。因此,miR-627-3p可以成為肺腺癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

最近發(fā)現(xiàn)程序性壞死的鐵死亡模式是一種不依賴細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡形式[9]。鐵死亡的特征在于脂質(zhì) ROS 的鐵依賴性致死性積累[10]。miRNA介導(dǎo)中間代謝產(chǎn)物的感知,以調(diào)節(jié)基因調(diào)控和疾病進(jìn)展,包括癌癥[11]。然而,miRNA與鐵死亡之間的聯(lián)系仍不清楚。本研究證明miR-627-3p可以減少脂質(zhì)ROS,減少了肺腺癌細(xì)胞鐵死亡水平。

最近研究發(fā)現(xiàn)STK11和KEAP1與SCD1的表達(dá)存在相關(guān)性[12]。SCD1是1種已知的鐵死亡調(diào)節(jié)劑[13]。SCD1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚不完全清楚;然而,啟動(dòng)子區(qū)域包含幾個(gè)眾所周知的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),包括 NF-1、AP-2、SREBP 和 PPAR[14]。STK11是1種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能夠磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子并促使轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)移進(jìn)行相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。KEAP1是1種泛素E3連接酶,能夠通過泛素化調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子入核[16]。因此,STK11和KEAP1可能對(duì)SCD1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了修飾,改變了SCD1的轉(zhuǎn)錄表達(dá),改變了細(xì)胞的鐵死亡水平。本研究結(jié)果首次表明miR-627-3p通過與 STK11和KEAP1相互作用在癌變過程中充當(dāng)重要的鐵死亡抑制劑,miR-627-3p是1種新型的鐵死亡調(diào)節(jié)因子。

肺腺癌的靶向治療已在一部分腫瘤患者中取得成功,這些患者攜帶一些單一驅(qū)動(dòng)突變,最顯著的是導(dǎo)致致癌激酶激活的突變[17]。因此,這種方法不能為腫瘤具有更復(fù)雜的腫瘤突變譜的患者提供治療策略,包括STK11和KEAP1突變[12]。鑒于基因的翻譯區(qū)突變改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象減少了靶向治療的效果,靶向治療的關(guān)注點(diǎn)可以從蛋白水平轉(zhuǎn)移到核酸水平,比如STK11和KEAP1的非翻譯區(qū)。

綜上所述,miR-627-3p作為抑癌因子發(fā)揮作用,以STK11 和 KEAP1依賴性方式抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-627-3p是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵分子,可作為肺腺癌治療的有效靶點(diǎn)。