朱景香 徐慧杰 吳鳳梅

膀胱癌(bladder cancer,BC)作為常見泌尿系統(tǒng)中的惡性腫瘤,臨床發(fā)病率高,死亡率也較高,對患者身體健康及生命安全造成極大危害[1]。BC可分為非肌層浸潤性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)及肌層浸潤性膀胱癌,其中NMIBC占比較大,且NMIBC會存在較大的復(fù)發(fā)可能性,不利于患者預(yù)后[2]。NMIBC治療方式以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)為主,但經(jīng)過電切術(shù)治療后仍存在高復(fù)發(fā)可能性。亞甲基四氫葉酸脫氫酶2(MTHFD2)作為與BC疾病進(jìn)展存在一定相關(guān)性的腫瘤標(biāo)志物,在癌細(xì)胞增殖、侵襲方面具有重要的作用。本研究選取我院NMIBC患者作為研究對象,以探討MTHFD2在其中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2019年6月至2020年7月NMIBC患者82例,男性49例,女性33例;單發(fā)腫瘤49例,多發(fā)腫瘤33例;WHO腫瘤分級I～I(xiàn)I級55例,Ⅲ級27例;吸煙史41例,無吸煙史41例;腫瘤直徑1～4 cm,平均(2.29±0.13)cm。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理檢查、膀胱鏡影像學(xué)檢查確診為NMIBC;②所有患者均接受經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療;③術(shù)前未進(jìn)行化療、放療等治療者。排除標(biāo)準(zhǔn):①膀胱結(jié)石者;②合并其他腫瘤者;③免疫系統(tǒng)疾病者。

1.3 方法

免疫組化染色法檢測:手術(shù)中取癌組織及癌旁組織。所有實驗步驟嚴(yán)格遵循說明方法操作。在脫蠟前將標(biāo)本切片置于溫度為37 ℃的烤箱內(nèi)烘片,等待一夜,待組織和切片密切貼附。將組織切片放在溫度為37 ℃的二甲苯溶液內(nèi),進(jìn)行15 min左右的浸泡,脫蠟后,將溶液替換后繼續(xù)浸泡15 min。將切片采用無水乙醇兩次、90%、80%、70%的乙醇各一次,將切片浸泡在其中5 min。進(jìn)行蒸水兩次,將切片浸泡在其中5 min。使用濃度為3.3%過氧化氫,將切片浸泡10 min,再運(yùn)用0.01%PBS緩沖液洗凈3次,每次5 min。使用羊血清液將切片封閉2 h,羊抗采用濃度為1%BSA封閉。在完成封閉后,開始一抗的配置,將血清擦凈后注入一抗,在環(huán)境為4 ℃下將切片孵育過夜。使用濃度為0.01%PBS緩沖液進(jìn)行3次沖洗,5 min/次。配置二抗,反應(yīng)1 h,將切片放置在37 ℃的烤箱中。采用濃度為0.01%PBS緩沖液進(jìn)行3次沖洗,5 min/次。配制顯色液染液,進(jìn)行避光儲存,于顯微鏡下染色處理,間隔一定時間后沖洗。采用蘇木精進(jìn)行染核40 s,運(yùn)用自來水沖洗20 min。使用1%的HCL對組織切片搖擺2次,水流沖洗10 min,通過鏡檢觀察染核狀況。將切片放置在通風(fēng)櫥內(nèi),進(jìn)行樹脂封片。采用37 ℃的烤箱進(jìn)行烘烤。對組織行400×顯微照相。經(jīng)由兩位病理醫(yī)師獨立閱片,當(dāng)MTHFD2定位在線粒體中,則為胞漿染色,當(dāng)其為深褐色或淺棕色時,則為陽性。參照組織著色的強(qiáng)度,給組織標(biāo)本進(jìn)行評分,按著色淺到深,記為0～2分。按照陽性細(xì)胞在總體細(xì)胞中的比例計算分值,<10%為1分,10%～50%為2分,>50%為3分。將組織染色的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞分布得分的乘積視為MTHFD2的表達(dá)狀況。按照以上計算分值方法進(jìn)行各個樣本計分,將總分值設(shè)為0～6分,其中<2分表示為陰性,≥2分為陽性。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)記錄MTHFD2 mRNA于BC、癌旁正常組織內(nèi)的差異。(2)記錄MTHFD2 mRNA與病理分期、預(yù)后關(guān)系。(3)記錄MTHFD2 mRNA蛋白表達(dá)狀況和病理參數(shù)關(guān)系。(4)隨訪時間5年,記錄BC組織內(nèi)MTHFD2蛋白表達(dá)和生存預(yù)后關(guān)聯(lián)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTHFD2 mRNA于癌組織、癌旁正常組織內(nèi)的差異

MTHFD2 mRNA在癌組織內(nèi)表達(dá)水平較癌旁正常組織高。見圖1。

圖1 MTHFD2 mRNA在NMIBC癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 MTHFD2與病理分期的關(guān)系

MTHFD2 mRNA于Ⅲ期、Ⅳ期患者組織中的表達(dá)對比Ⅱ期患者存在明顯增高趨勢。見圖2。

圖2 MTHFD2 mRNA在NMIBC各分期中的表達(dá)

2.3 MTHFD2 mRNA蛋白表達(dá)狀況和病理參數(shù)關(guān)系

82例患者中60例患者癌組織內(nèi)MTHFD2蛋白表達(dá)為陽性,其陽性率為73.17%;其對應(yīng)的癌旁正常組織內(nèi),存在14.63%表達(dá)為陽性。NMIBC組織內(nèi)MTHFD2蛋白表達(dá)狀況和腫瘤數(shù)目、大小、病理分期等病理參數(shù)存在關(guān)聯(lián)(P<0.05)。見表1。

表1 MTHFD2 mRNA蛋白表達(dá)狀況和病理參數(shù)關(guān)系(例,%)

2.4 MTHFD2蛋白表達(dá)和生存預(yù)后關(guān)聯(lián)

MTHFD2蛋白陽性表達(dá)組患者術(shù)后無瘤生存時間[(36.45±2.39)個月]較陰性表達(dá)組[(49.36±2.46)個月]短(t=24.086,P<0.001)。

3 討論

BC作為臨床泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤,主要受遺傳、環(huán)境等多種因素影響,也與慢性炎癥、化工染料等因素有關(guān)[3-4]。該病每年新發(fā)病例較多,且病死率較高,大部分患者為NMIBC[5]。臨床治療后大部分患者仍會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā),預(yù)后情況較差。按照患者復(fù)發(fā)可能性、臨床預(yù)后情況的差異又能區(qū)別為低、中、高NMIBC。NMIBC患者缺乏及時有效治療,會侵襲固有層,存在高度異質(zhì)性,在治療完成后仍會再次復(fù)發(fā)[6]。臨床上采取的外科手術(shù)療法,雖然能將腫瘤組織全部清除,可預(yù)后情況仍不夠理想。挑選合適的預(yù)測生物學(xué)標(biāo)志物,有利于分辨患者預(yù)后狀況,予以針對性的有效治療[7-8]。采取有效的標(biāo)志物檢測手段能在一定程度上規(guī)避癌癥復(fù)發(fā)的可能性,在將臨床上發(fā)現(xiàn)的腫瘤清除后,且能對腫瘤組織分級、評估分期,利于后續(xù)的治療計劃,實現(xiàn)控制癌癥進(jìn)展的目的。MTHFD2作為一碳代謝關(guān)鍵酶,在多種腫瘤細(xì)胞組織內(nèi)存在表達(dá)跡象,且其表達(dá)水平被認(rèn)為和癌癥患者預(yù)后情況呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[9]。

MTHFD2 mRNA在BC組織內(nèi)表達(dá)水平較正常組織高,提示BC組織內(nèi)MTHFD2 mRNA水平存在高表達(dá)狀況?？赡茉蛟谟?細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞程序化死亡的過程,而MTHFD2作為參與細(xì)胞內(nèi)葉酸代謝反應(yīng)關(guān)鍵酶,同時葉酸又和細(xì)胞增殖活動存在緊密關(guān)聯(lián),具備亞甲基四氫葉酸脫氫酶、環(huán)化水解酶雙重活性,能幫助葉酸代謝產(chǎn)物進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化。癌細(xì)胞中具備快速糖酵解、合成氨基酸等合成及代謝過程,能幫助癌細(xì)胞迅速增殖,其中受四氫葉酸輔助因子具備的單碳單元合成在癌細(xì)胞增殖中存在積極作用[10]。研究提示臨床癌癥分期較高者M(jìn)THFD2 mRNA水平也較高。分析原因在于,MTHFD2 mRNA是人類第二染色體上基因所編碼的線粒體酶,該基因?qū)δ[瘤細(xì)胞這類快速增殖的細(xì)胞來說具備極為重要的作用,能支持腫瘤細(xì)胞所需的高水平嘌呤合成[11]。受癌細(xì)胞的代謝特性影響,癌組織長期位于高濃度活性氧內(nèi),活性氧的大量增多會對細(xì)胞周期發(fā)生抑制作用,促細(xì)胞凋亡。MTHFD2經(jīng)平衡葉酸代謝內(nèi)的氧化還原,減少活性氧含量,阻斷癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在存在高度增殖的癌組織內(nèi),線粒體葉酸通路內(nèi)MTHFD2 mRNA、蛋白表達(dá)水平均增高,且和患者預(yù)后不良存在關(guān)系[12]。本研究數(shù)據(jù)顯示,82例患者中,存在60例患者癌組織內(nèi)MTHFD2蛋白表達(dá)為陽性,其陽性率為73.17%,其對應(yīng)的癌旁組織內(nèi),存在14.63%表達(dá)為陽性,且BC組織內(nèi)MTHFD2蛋白表達(dá)狀況和腫瘤數(shù)目、大小、病理分期等病理參數(shù)存在關(guān)聯(lián)(P<0.05)。分析原因在于,MTHFD2具備提高腫瘤細(xì)胞組織增殖、侵襲能力,能有效促進(jìn)癌癥的產(chǎn)生、進(jìn)展[13]。MTHFD2可在快速增殖的惡性腫瘤內(nèi)過度表達(dá),參與線粒體內(nèi)一碳代謝、嘌呤合成,是癌組織快速增長的要素[14]。此外,本研究數(shù)據(jù)還顯示,MTHFD2蛋白陽性表達(dá)組患者術(shù)后無瘤生存時間較陰性表達(dá)組短(P<0.05),提示MTHFD2蛋白陽性表達(dá)者預(yù)后不良狀況更明顯。抑制MTHFD2表達(dá)能抑制癌細(xì)胞增殖,阻斷其發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。通過抑制MTHFD2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),能有效延長患者預(yù)后生存周期。

綜上所述,NMIBC組織內(nèi)MTHFD2水平的高表達(dá)提示患者可能存在預(yù)后不佳狀況,其可作為NMIBC臨床預(yù)后的潛在指標(biāo)。