李娜娜 陳園園

甲狀腺癌是臨床較為常見的內(nèi)分泌腫瘤之一[1],分化型甲狀腺癌占甲狀腺癌的80%～85%[2]。目前對(duì)于甲狀腺癌患者的治療通常采取甲狀腺全切手術(shù)進(jìn)行治療。研究顯示[3],甲狀腺癌病灶部位的切除對(duì)周邊細(xì)胞的增生具有顯著的抑制性作用。而在周圍細(xì)胞的抑制作用中,多種免疫細(xì)胞、生長因子以及凋亡因子的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 主要存在于癌細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞中,在甲狀腺癌的疾病進(jìn)展中,VEGF主要是由甲狀腺癌細(xì)胞產(chǎn)生,并向細(xì)胞外進(jìn)行分泌[4],同時(shí)與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體相互結(jié)合促進(jìn)周圍細(xì)胞的增生。在腫瘤的進(jìn)展過程中,慢性炎性反應(yīng)參與了甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡[5]。有研究推測(cè)認(rèn)為[6],可溶性受體Fas(sFas)以及可溶性受體配體(sFasL)通過對(duì)機(jī)體免疫功能的顯著性抑制性作用,抑制癌細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫功能的逃逸作用。本研究主要通過甲狀腺切除術(shù)對(duì)甲狀腺癌荷瘤小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響分析,為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本研究儀器主要采取酶標(biāo)儀(DNM-9602,北京普朗新技術(shù)有限公司)、冷凍離心機(jī)(TGL20M,JTLIANGYOU);恒溫水浴箱(HH-W420/W600)進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫細(xì)胞分析采用流式細(xì)胞儀(Moflo XDP型,貝克曼)進(jìn)行分析,機(jī)體的炎性因子分析采用酶標(biāo)儀進(jìn)行,sFas、sFasL、VEGF采用western blot方法進(jìn)行檢測(cè)。所有試劑均來自上海羅氏,操作流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用由中科院提供的雄性SPF級(jí)新生小鼠60只(合格證號(hào)為20170516),體重180～217 g,平均體重為(213.33±2.39)g,室溫控制在(21±2)℃,濕度30%～70%,光照每晝夜12 h。

1.3 模型構(gòu)建與干預(yù)方法

模型組:采取40只以上小鼠進(jìn)行模型制備,采用含有10%的胎牛血清培養(yǎng)液(WE)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),腫瘤細(xì)胞來自中科院上海細(xì)胞庫的甲狀腺癌TT細(xì)胞株,培養(yǎng)完成后,將以上細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,在室溫37 ℃以及含有5% CO2的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為6～7天,在培養(yǎng)瓶中,腫瘤細(xì)胞在瓶底長滿后,使用0.25%的胰酶對(duì)以上細(xì)胞進(jìn)行消化并離心。采用磷酸鹽緩沖液制備腫瘤細(xì)胞懸液,腫瘤細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為2.0×107/ml,對(duì)模型組實(shí)驗(yàn)小鼠在頸背部進(jìn)行皮下注射,注射劑量為100 μL。每兩日對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的體重進(jìn)行稱重,并對(duì)腫瘤長徑以及短徑進(jìn)行測(cè)量,計(jì)算腫瘤的體積。腫瘤體積達(dá)到80 mm3后開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

手術(shù)組:挑選模型組中20只小鼠喂養(yǎng)8周后進(jìn)行甲狀腺全切除手術(shù)。

對(duì)照組:對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠20只進(jìn)行頸背部注射生理鹽水100 μL。

1.4 標(biāo)本處理與觀察項(xiàng)目

1.4.1 sFas、sFasL、VEGF水平檢測(cè) 對(duì)3組小鼠的甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行處理后,棄去培養(yǎng)基,使用等量的磷酸鹽緩沖液對(duì)以上細(xì)胞進(jìn)行沖洗2次,徹底清除殘留的培養(yǎng)基。使用十二烷基硫酸鈉樣品緩沖液進(jìn)行沖洗,去除細(xì)胞,同時(shí)對(duì)將以上溶液轉(zhuǎn)移至EP管中,使用沸水煮沸5 min,采用凝膠電泳法(SDS聚丙烯酰胺)進(jìn)行電泳,在聚偏氟乙烯進(jìn)行轉(zhuǎn)印,使用封閉液(0.1 ml/cm2)進(jìn)行封閉1 h,在一抗作用下進(jìn)行過夜,過夜溫度為4 ℃。將以上轉(zhuǎn)移槽在冰浴中進(jìn)行添加轉(zhuǎn)移緩沖液,在100 V電流作用1 h,使用25 ml的TBS 進(jìn)行洗膜5 min,加入適量的辣根過氧化酶標(biāo)記物標(biāo)記的二抗進(jìn)行室溫孵育1 h。使用顯色法對(duì)sFas、sFasL、VEGF水平檢測(cè)。

1.4.2 炎性因子水平比較 分別對(duì)3組小鼠進(jìn)行靜脈采血3 ml,5000 r/min離心15 min后,分離血清,采用放射免疫分析法對(duì)腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)以及白介素6(IL-6)水平進(jìn)行分析。

1.4.3 T細(xì)胞以及B細(xì)胞的增殖活性比較 取出3組小鼠的脾臟,并進(jìn)行稱重,計(jì)算3組小鼠的脾指數(shù)(SI)。SI=脾重(mg)/體重(g)。計(jì)算脾指數(shù)后,在無菌狀態(tài)下制作淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后,將以上細(xì)胞懸液接種于96孔的板中,使用20 mg/ml的脂多糖進(jìn)行刺激,48 h后對(duì)以上細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn),使用酶標(biāo)儀對(duì)小鼠的脾臟T細(xì)胞以及B細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 免疫細(xì)胞水平比較 采用流式細(xì)胞儀對(duì)3組小鼠的血漿進(jìn)行檢測(cè),比較3組小鼠的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、髓源性抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、自然殺傷性細(xì)胞(natural killer cell,NK)、B細(xì)胞水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。多組比較,采用方差分析,兩兩比較,采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,采用卡方檢驗(yàn)分析。P<0.05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sFas、sFasL、VEGF水平比較

3組小鼠sFas(F=11.231,P=0.000)、sFasL(F=6.672,P=0.000)、VEGF(F=12.231,P=0.000)之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過兩兩比較,3組小鼠的sFas、sFasL、VEGF水平從高到低依次為模型組、手術(shù)組以及對(duì)照組。詳見表1、圖1。

圖1 3組sFas、sFasL、VEGF水平比較

表1 3組小鼠sFas、sFasL、VEGF水平比較

2.2 炎性因子水平比較

3組小鼠的TNF-α(F=11.549,P=0.000)、IL-1β(F=12.598,P=0.000)、IL-6(F=8.997,P=0.000)之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過兩兩比較,3組小鼠的炎性因子水平從高到低依次為模型組、手術(shù)組以及對(duì)照組,詳見表2。

表2 3組炎性因子水平比較

2.3 T細(xì)胞以及B細(xì)胞的增殖活性比較

3組小鼠的SI(F=7.006,P=0.000)、T細(xì)胞增殖活性(F=6.111,P=0.000)、B細(xì)胞增殖活性(F=8.098,P=0.000)之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,經(jīng)過兩兩比較,3組小鼠的SI、T細(xì)胞增殖活性、B細(xì)胞增殖活性從高到低依次為對(duì)照組、手術(shù)組以及模型組,詳見表3。

表3 3組T細(xì)胞以及B細(xì)胞的增殖活性比較

2.4 免疫細(xì)胞水平比較

3組小鼠的CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Treg、NK之間的差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),3組小鼠的CD4+T細(xì)胞(F=12.090,P=0.000)、CD4+/CD8+(F=12.443,P=0.000)、MDSC(F=12.112,P=0.000)、B細(xì)胞比例(F=12.145,P=0.000)之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過兩兩比較,CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、B細(xì)胞比例從高到低依次為對(duì)照組、手術(shù)組以及模型組,MDSC從高到低依次為模型組、手術(shù)組以及對(duì)照組,詳見表4。

表4 3組免疫細(xì)胞水平比較

3 討論

甲狀腺癌是臨床較為常見的惡性腫瘤之一[7],目前對(duì)于甲狀腺癌的治療主要采取手術(shù),手術(shù)治療效果已經(jīng)明確。但是關(guān)于手術(shù)治療后機(jī)體的細(xì)胞凋亡以及新生血管的抑制機(jī)制尚不明確[8],通過對(duì)以上機(jī)制的分析,對(duì)于日后甲狀腺癌復(fù)發(fā)以及治療效果的評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值。

在甲狀腺癌細(xì)胞的進(jìn)展過程中,機(jī)體的甲狀腺組織細(xì)胞發(fā)生顯著的變化,甲狀腺周邊細(xì)胞的增生能力顯著升高,平滑肌顯著肥大,新生血管的形成能力顯著升高[9]。通過對(duì)甲狀腺模型實(shí)驗(yàn)小鼠的手術(shù)切除,相比模型組,手術(shù)組小鼠的sFas、sFasL、VEGF水平顯著下降,分析認(rèn)為,在甲狀腺癌的模型制備成功后,會(huì)刺激實(shí)驗(yàn)小鼠大量分泌缺氧誘導(dǎo)因子1α[10],該因子對(duì)于VEGF轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)具有顯著的意義,進(jìn)而參與了腫瘤進(jìn)展。而作為凋亡因子水平sFas、sFasL的顯著下降,也反映了機(jī)體的正常細(xì)胞以及免疫細(xì)胞的凋亡水平下降[11],對(duì)于機(jī)體的恢復(fù)具有重要意義。在實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行甲狀腺全切手術(shù)后,炎性因子水平顯著下調(diào),提示,對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的腫瘤組織進(jìn)行切除后,腫瘤組織分泌物質(zhì)造成的內(nèi)環(huán)境被破壞[12],對(duì)正常細(xì)胞的炎性反應(yīng)具有顯著的下調(diào)作用。李亞南等通過對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的甲狀腺癌組織進(jìn)行切除后,實(shí)驗(yàn)小鼠的生長因子以及凋亡因子顯著下調(diào),與本研究相互印證[13]。

而在對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫細(xì)胞活性以及相關(guān)免疫細(xì)胞的水平分析中,隨著手術(shù)的進(jìn)行,手術(shù)組實(shí)驗(yàn)小鼠的T細(xì)胞以及B細(xì)胞的增殖活性顯著恢復(fù),CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、MDSC、B細(xì)胞比例顯著回升。研究認(rèn)為,在腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展過程中,機(jī)體的免疫監(jiān)視以及攻擊作用一直存在,但是,隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展,導(dǎo)致機(jī)體免疫細(xì)胞的增殖活性下降,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力的顯著上升[14]。CD4+介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用可顯著促進(jìn)CD8+以及B細(xì)胞的增殖,進(jìn)而提升機(jī)體的免疫應(yīng)答水平,而在本研究中,相比模型組,手術(shù)組實(shí)驗(yàn)小鼠的CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+均顯著上升,而CD8+水平未見顯著異常改變。提示,對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的甲狀腺癌組織的切除,可促使正常細(xì)胞以及免疫細(xì)胞的抑制作用顯著下降,CD4+顯著回升[15]。另外,在對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的MDSC、B細(xì)胞比例水平的分析中,相比模型組,手術(shù)組實(shí)驗(yàn)小鼠的MDSC、B細(xì)胞比例顯著提高,分析認(rèn)為,MDSC的累積作用是造成免疫抑制的主要原因,在多種腫瘤細(xì)胞的研究中已經(jīng)證實(shí),MDSC與腫瘤對(duì)免疫細(xì)胞的逃逸作用顯著相關(guān),而在本研究中在對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行甲狀腺組織的切除后,MDSC顯著下降。

綜上所述,甲狀腺癌荷瘤小鼠進(jìn)行甲狀腺手術(shù)全切后,可能通過上調(diào)CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、B細(xì)胞水平,下調(diào)MDSC水平,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸作用。