劉麗平, 陳素梅, 劉東聲, 朱 青, 梁 偉

1.徐州醫(yī)科大學,江蘇 徐州 221004;2.徐州醫(yī)科大學附屬宿遷醫(yī)院 檢驗科,江蘇 宿遷 223800;3.連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院 檢驗科,江蘇 連云港 222100;4.徐州醫(yī)科大學連云港臨床學院 檢驗科,江蘇 連云港 222000

腦卒中為多種原因所致腦組織缺血、缺氧病變,進而產(chǎn)生對應的神經(jīng)損傷表現(xiàn)。氯吡格雷是腦卒中后最常用的抗血小板藥物之一,在卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者卒中預防指南中常被推薦作為缺血性卒中的一級治療和二級預防[1-2]。氯吡格雷屬于前體藥物,在肝中通過CYP2C19酶代謝后產(chǎn)生可以選擇性抑制ADP與P2Y12受體相結合產(chǎn)物,從而對血小板聚集有抑制作用。CYP2C19酶由CYP2C19基因編碼組成,其基因存在顯著的遺傳多態(tài)性和種族分布差異。有研究報道,CYP2C19等位基因中的*2、*3及*17基因均對氯吡格雷代謝產(chǎn)生一定的影響[3-4]。CYP2C19*17是由于CYP2C19基因側翼序列5′端806位點C>T突變,增加CYP2C19 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,進而可以增加CYP2C19蛋白產(chǎn)物。有研究報道,攜帶CYP2C19*17等位基因純合子與雜合子的出血風險分別是未攜帶者的3.41倍和1.85倍[5]。CYP2C19*17基因型攜帶者會促進氯吡格雷活性代謝物的產(chǎn)生、增強血小板聚集抑制效果、提高出血風險及降低缺血事件風險等方面存在一定的相關性[5-7]。根據(jù)CYP2C19基因*2、*3、*17位點基因型,可將CYP2C19酶分為4類：慢代謝型(*3/*3,*2/*3,*2/*2)、中間代謝型(*17/*3,*17/*2,*1/*3,*1/*2)、快代謝型(*1/*1)及超快代謝型(*17/*17,*1/*17)[8]。分析CYP2C19基因多態(tài)性可推斷其代謝表型,進而可預測藥物代謝能力及藥物療效,指導臨床合理用藥。本研究基于等位基因特異性原理,建立快速檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法,探索特異性檢測最佳反應條件,并運用所建立方法對健康人群和腦卒中人群CYP2C19基因多態(tài)性等位基因的分布頻率進行初步分析,探究等位基因分布與氯吡格雷抵抗的相關性?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年1—6月在徐州醫(yī)科大學附屬宿遷醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且診斷為初發(fā)急性腦卒中的77例患者設為腦卒中組,其中,男性44例,女性33例;平均年齡(57.3±11.9)歲。納入標準：年齡>18歲;漢族;籍貫為宿遷;明確診斷為急性腦卒中,以《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[9]為診斷依據(jù)。另選取同期于本院體檢中心進行健康體檢且無血緣關系的200例健康體檢者設為健康組,其中,男性103例,女性97例;平均年齡(38.7±12.3)歲。納入標準：無慢性病;漢族;籍貫為宿遷;經(jīng)過一般體檢,排除其他慢性疾病;標本采集前1周內(nèi)未服用藥物。兩組研究對象一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。所有研究對象均對本研究知情同意。

1.2 基因組DNA提取 分別采集兩組研究對象的外周抗凝血液,采用DNA提取試劑盒(天根生化科技公司),參照說明書操作,提取基因組DNA,經(jīng)核酸濃度檢測儀測定其濃度及純度后,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 單特異性引物設計 參照GenBank中的CYP2C19基因序列,利用Premier 6.0軟件設計引物。根據(jù)SNP位點等位基因不同,在引物的3′設計一對等位基因特異性擴增引物,達到只能特異性擴增目標堿基而不擴增其他堿基的目的。在引物3′末端倒數(shù)第二位或倒數(shù)第三位甚至倒數(shù)第四位引入錯配堿基(表1),以增加引物的特異性[10]。同時設計了一對內(nèi)對照引物(Humanβ-Actin-F,Humanβ-Actin-R),以排除因聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)體系中某成分漏加,造成假陰性結果。

1.4 聚合酶鏈反應-序列特異性引物反應體系及退火溫度的選擇 30 μl反應體系：包含2×PCR預混液15 μl,正向rs4986893-R)、(rs12248560-F,rs12248560-R)各15 pmol,模板DNA 50～100 ng,剩余體積以雙蒸水補足。反應條件設定為：94℃預變性5 min,94℃變性30 s,退火30 s,每對引物設置8個反應管,退火溫度分別為延伸40 s,30個循環(huán)后,PCR產(chǎn)物4℃保存。反應產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離,凝膠成像儀觀察結果,選擇無非特異擴增條帶且特異性擴增條帶最亮的反應管,對應的退火溫度為后續(xù)反應的退火溫度。

表1 單特異性引物列表

1.5 構建重組質(zhì)粒 切下大小正確的PCR產(chǎn)物條帶,用膠回收試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)純化回收PCR產(chǎn)物,將純化的PCR產(chǎn)物連接至T-載體,得到重組質(zhì)粒,經(jīng)測序驗證帶有目的片段的重組質(zhì)粒分別命名為：T681A,T681G;T636A,T636G;T-806C,T-806T。

用上述得到的重組質(zhì)粒模擬不同基因型：T681A,模擬681A/A純合子;T681G,模擬681G/G純合子;T681A、T681G以1∶1混合模擬681G/A雜合子。同理可得636A/A,636G/G,6363G/A;-806C/C,-806T/T,-806C/T等基因型的純合子和雜合子。

1.6 聚合酶鏈反應-序列特異性引物擴增準確性驗證 探究聚合酶鏈反應-序列特異性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)敏感性及抗干擾性后并應用PCR-SSP法對健康組與腦卒中組進行PCR擴增,隨機按比例挑選30%純合子和雜合子用測序引物擴增后(F+R),對PCR產(chǎn)物進行基因測序,經(jīng)測序驗證結果與PCR-SSP法檢測結果完全一致。

2 結果

2.1 PCR-SSP反應退火溫度的確定 溫度梯度PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,在57℃～60℃范圍內(nèi)均可擴增出特異性條帶,且在59℃時條帶最亮,為獲得較高分辨率,后續(xù)選擇59℃為最佳退火溫度,以確保特異性PCR的準確性。

2.2 PCR-SSP檢測CYP2C19基因型 用質(zhì)粒模擬3個SNP位點的各種基因型,經(jīng)PCR-SSP反應后,各基因型均可準確分辨。對健康組和腦卒中組DNA樣本PCR-SSP反應,每個標本采用一對單特異性反向引物與共同正向引物平行擴增,每個反應孔中均可見747 bp的內(nèi)對照PCR產(chǎn)物,特異性引物擴增產(chǎn)物分別為132 bp、376 bp、341 bp。

2.3 PCR-SSP敏感性及干擾性探究 單特異性引物聚合酶鏈反應引物敏感性及抗干擾性能對反應至關重要,本研究中CYP2C19基因3個SNP位點的單特異性擴增引物敏感度分別為：rs4244285G,103 copies/μl;rs4244285A,104 copies/μl;rs4986893G,102 copies/μl;rs4986893A,104 copies/μl;rs12248560C,105 copies/μl;rs12248560T,105 copies/μl。

2.4 DNA測序驗證 隨機挑選部分標本,采用引物對(rs4244285-F+rs4244285-R)、(rs4986893-F+rs4986893-R)、(rs12248560-F+rs12248560-R)進行PCR,產(chǎn)物直接測序,與PCR-SSP法檢測結果對比,完全一致。見圖1。

2.5 江蘇宿遷地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分布 采用單特異性引物對健康組和腦卒中組樣本DNA進行PCR反應。對野生型基因中攜帶1個功能缺失的等位基因、攜帶2個功能缺失的等位基因,以及攜帶功能增強等位基因頻率進行比較,結果顯示,腦卒中組中,攜帶2個功能缺失等位基因患者的頻率明顯高于健康組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

77例腦卒中患者存在氯吡格雷抵抗的患者30例,氯吡格雷敏感47例;其中,未攜帶功能缺失等位基因25例,發(fā)生氯吡格雷抵抗4例(16.0%);攜帶一個功能缺失等位基因30例,發(fā)生氯吡格雷抵抗9例(30.0%);攜帶兩個功能缺失等位基因22例,發(fā)生氯吡格雷抵抗17例(77.3%)。攜帶兩個功能缺失等位基因氯吡格雷抵抗發(fā)生率高于氯吡格雷敏感,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

圖1 CYP2C19基因測序結果

表2 宿遷地區(qū)漢族健康組與腦卒中組基因頻率比較/例(百分率/%)

表3 腦卒中組氯吡格雷不同代謝情況的CYP2C19基因頻率比較/例(百分率/%)

3 討論

卒中后常規(guī)使用抗血小板藥物治療,并使用氯吡格雷藥物治療,可顯著降低急性卒中患者復發(fā)的風險,是預防急性卒中后再梗死的重要治療方法[11]。細胞色素P450(CYP)酶系在抗血小板藥物氯吡格雷代謝中占有極其重要的地位[12]。CYP2C19(S-美芬妥英羥化酶)是CYP酶系中占主導地位的酶之一,其遺傳多態(tài)性對臨床藥物的代謝產(chǎn)生一定的影響,且由于該酶活性的個體差異較大,造成不同個體的藥物不良反應及藥物治療效率產(chǎn)生較為嚴重的影響[13]。氯吡格雷在常規(guī)劑量下治療慢代謝型患者時,會使其活性代謝物及抑制血小板聚集作用降低,提高了血栓形成的風險;而在超快代謝型患者中產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物增加,抑制血小板聚集作用增強,出血風險相對增加。因此,2010年美國食品及藥物管理局修改了黑框警告：CYP2C19基因型結果可作為醫(yī)師治療策略調(diào)整的參考[14]。

氯吡格雷是一種前體藥物,其自身不具有活性,但經(jīng)過小腸吸收后約85%的藥物前體經(jīng)過酯酶水解作用變成了無活性物質(zhì),其他約15%的前體藥物會通過肝生成的代謝產(chǎn)物具有活性。氯吡格雷作為ADP受體拮抗劑之一,可以結合血小板膜表面ADP受體,并能阻礙血小板膜糖蛋白與纖維蛋白原的結合,從而產(chǎn)生血小板聚集抑制的現(xiàn)象[15]。但在臨床中,部分患者應用標準劑量的氯吡格雷后,并不能取得預期的抑制血小板聚集效果,被稱為氯吡格雷抵抗或血小板高反應性[16]。對氯吡格雷藥效產(chǎn)生影響的因素除了患者年齡、性別、藥物相互作用、吸煙與否、糖尿病及高血脂等因素外,CYP2C19的基因多態(tài)性具有重要的作用[17]。有研究報道,CYP2C19基因上已有超過35個SNP位點,而大部分位點在亞洲人群中出現(xiàn)的頻率<1%[18]?；贑YP2C19基因的SNP位點在亞洲人群中的分布情況,本研究選擇對CYP2C19*2、*3、*17以及*1(野生型)進行檢測。近年來研究發(fā)現(xiàn),CYP2C19酶活性差異與其基因多態(tài)性密切相關,基因型與表型間有良好的一致性?；驒z測較蛋白活性測定具有操作簡便且結果穩(wěn)定的優(yōu)勢,但同時具有檢測成本高昂、耗時長等缺點。本研究旨在建立快速、靈敏且經(jīng)濟實惠的檢測方法(PCR-SSP),引物設計和退火溫度選擇是該檢測方法的關鍵環(huán)節(jié),PCR-SSP法檢測CYP2C19基因SNP位點多態(tài)性是基于引物3′末端堿基與模板互補,引入倒數(shù)第二或倒數(shù)第三甚至倒數(shù)第四位堿基錯配,增加引物與模板結合不穩(wěn)定性,進而提高檢測特異性。

本研究共納入200例健康者與77例腦卒中患者,運用PCR-SSP法檢測并分析CYP2C19基因多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)腦卒中患者中,同時攜帶2個功能缺失等位基因(CYP2C19*3、CYP2C19*2)的頻率顯著高于健康組,其原因可能是動脈粥樣硬化為腦卒中發(fā)病的常見病因,而血小板聚集學說是眾多闡述動脈粥樣硬化的發(fā)病機制學說之一[19]。經(jīng)血栓彈力圖檢測,發(fā)生氯吡格雷抵抗患者共30例,其中,攜帶兩個功能缺失等位基因的患者22例,攜帶兩個功能缺失等位基因患者氯吡格雷抵抗發(fā)生率為77.3%(17/22);未攜帶功能缺失等位基因的患者中也有4例存在氯吡格雷抵抗現(xiàn)象,說明氯吡格雷抵抗現(xiàn)象的發(fā)生不僅與患者自身基因型相關,還可能與其服用的藥物、基礎疾病或接受其他治療手段等因素相關。此外,由于個體用藥后存在明顯差異,依臨床治療時的常規(guī)劑量用藥,可能會致使部分患者出現(xiàn)過高的血藥濃度而發(fā)生中毒現(xiàn)象,或出現(xiàn)過低的血藥濃度而無法起到治療的效果。因此,可通過基因檢測確定患者的基因類型,依基因多態(tài)性結果用藥,及時調(diào)整藥物的劑量或品種,個體化用藥,進而提高治療效果、降低不良反應發(fā)生率。

綜上所述,PCR-SSP法可用于CYP2C19基因型的快速檢測,明確宿遷地區(qū)漢族人群的CYP2C19基因型情況,證實慢代謝型(*3/*3,*2/*3,*2/*2)患者基因型與氯吡格雷抵抗的發(fā)生存在相關性。