王 瓊, 張 成, 王鑫宇, 張 倩, 劉 洋, 柳云恩

1.沈陽醫(yī)學院樹人國際學院,遼寧 沈陽 110034;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科,遼寧 沈陽 110016

結直腸癌是全球最常見的癌癥之一,也是致癌死亡的主要原因[1]。近年來,結直腸癌發(fā)病率明顯增加,約占所有癌癥的10%,是癌癥死亡的第二大常見原因,嚴重危害身體健康[2-3]。盡管早期篩查方法和治療方案的研究發(fā)展有助于顯著改善結直腸癌患者預后,但結直腸癌仍然存在較大的健康隱患[4]。雖然,輔助化療取得了一定效果,但腫瘤的異質性和疾病的危險因素使得結直腸癌患者的臨床轉歸和治療反應差異很大[5]。因此,通過腫瘤生物學的多樣性,篩選更有意義的診斷標志物用于患者風險分層和早期發(fā)現(xiàn),可能會延長結直腸癌患者的總生存期。核糖體蛋白L4(ribosomal protein L4,RPL4)屬于核糖體家族,該基因編碼核糖體蛋白,是60S亞基的組成部分。有研究報道,核糖體的缺乏伴隨著p53通路的激活[6]。RPL4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,RPL4的表達上調與腫瘤患者的預后呈負相關,可促進腫瘤細胞的增殖和分化。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn),過氧化物還原蛋白PRDX2可以結合RPL4,從而阻礙RPL4-MDM2結合,并導致p53降解,促進結直腸癌細胞增殖。但目前關于RPL4在結直腸癌中功能方面的研究報道較少見,RPL4可能是一個具有前景的治療靶點,可為結直腸癌患者提供個體化治療,并為臨床治療奠定理論基礎。本研究旨在探討RPL4在結直腸癌患者中的預后價值及生物學意義?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及處理 從癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA GDC,https：//portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載結直腸癌及正常結直腸組織的mRNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息[8],其中,具有完整信息的有524例結直腸癌患者的mRNA測序,42例患者可進行配對差異分析,417例患者具有完整的總生存期和生存狀態(tài),將上述患者的臨床數(shù)據(jù)納入研究。此外,對mRNA-seq數(shù)據(jù)的mRNA表達量用log2(UMI+1)進行標準化,并通過其平均值反映映射到多個探針的基因。在本研究中,數(shù)據(jù)經過質量控制,排除存活時間≤30 d、信息不明確患者的結直腸癌樣本。

1.2 RPL4表達情況及生存分析 將TCGA中結直腸癌患者按RPL4 mRNA表達排序,根據(jù)其中位值,將結直腸癌患者分為RPL4高表達組和RPL4低表達組。采用“survival”(3.2-13版本)和“survminer”R包進行Kaplan-Meier生存分析,構建RPL4高表達組和低表達組組間的Kaplan-Meier生存曲線,評估RPL4是否為總生存期的預后因素。

1.3 RPL4的單細胞數(shù)據(jù)分析 在腫瘤免疫單細胞中心(http：//tisch.comp-genomics.org/documentation/,TISCH)進行相關的單細胞分析[9]。分析參數(shù)如下：RPL4(基因)、主要譜系(細胞類型注釋)和結直腸癌(癌癥類型)。通過TISCH內部處理后可視化每種細胞類型中RPL4的表達水平。

1.4 GSEA富集分析 采用GSEA軟件,利用從分子特征數(shù)據(jù)庫(MSigDB,https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)下載的京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)集和Hallmark基因集對RPL4高表達和低表達組進行通路富集分析,探討RPL4在結直腸癌中的生物學功能[10]。將錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.25及歸一化富集分數(shù)的絕對值>2.0定義為截止標準。

1.5 藥物敏感性分析 通過國家癌癥研究所研究中心建立的Cell Miner數(shù)據(jù)庫下載經過處理后的RNA表達數(shù)據(jù)(RNA：RNA-seq)和藥物數(shù)據(jù)(Compound activity：DTP NCI-60)[11],選取經過546種臨床試驗和314種美國食品和藥物管理局(food and drug administration,FDA)批準的藥物結果。采用最近鄰平均impute.knn函數(shù)補齊藥物缺失數(shù)據(jù),采用limma包計算RPL4高表達組和低表達組間的藥物敏感性。

1.6 免疫組織化學法 通過在線數(shù)據(jù)庫人類蛋白質圖譜Human Protein Atlas(HPA,https：//www.proteinatlas.org/)分析RPL4基因在結直腸腫瘤組織和正常組織中蛋白水平的表達情況[12]。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應 由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科收集20例結直腸癌組織及對應癌旁標本。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測RPL4的mRNA表達水平,按照新一代RNA提取試劑NucleoZOL(MNG,德國,貨號：740404.200)說明書步驟提取結直腸組織的總RNA,使用紫外分光光度儀檢測mRNA含量。隨后采用天根反轉錄試劑盒,制備20 μl體系cDNA,最終采用天根熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒對cDNA進行PCR反應。引物序列設計如下,RPL4-Forward：AGATGAATTGTACGGCACTTGG,RPL4-Reverse：GACTCTGCGATGGATCTTCTTG;GAPDH-Forward：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG。GAPDH-Reverse：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。PCR反應條件為預變性：95℃、30 s;變性：95℃、10 s,60℃、30 s ,40個循環(huán);退火/延伸：60℃、30 s。記錄CT值,按照2-△△CT法計算RPL4在正常結直腸組織和結直腸癌組織中表達的相對水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 在線數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在R軟件(版本4.1.1)(https：//www.r-project.org/)和Perl軟件(版本10.0.22000.675)中進行。定量PCR檢測采用GraphPad Prism v8.0軟件進行統(tǒng)計學分析,組內比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RPL4在結直腸癌中表達上調與較差預后相關 結直腸癌組織樣本中RPL4的表達水平明顯高于正常組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,圖1a)。將42例配對患者進行差異分析,結直腸癌組織樣本中RPL4的表達水平大多高于正常組織(圖1b)。生存分析結果顯示,將納入的417例具有完整信息的結直腸癌患者根據(jù)中位值將其分為RPL4高表達組和低表達組,低表達組的總生存期明顯長于高表達組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)[a.結直腸癌組織中RPL4的表達高于正常組織;b.在每個患者的腫瘤組織中,RPL4的表達水平普遍高于正常組織;y軸為樣本RPL4表達的log2(TPM)值] 圖2 RPL4的Kaplan-Meier生存分析結果

2.2 RPL4在結直腸癌中單細胞分析 使用TISCH數(shù)據(jù)庫在GSE166555數(shù)據(jù)集中分析RPL4在CRC中的13種細胞類型(包括免疫細胞、基質細胞、惡性細胞等)的表達水平(圖3),結果發(fā)現(xiàn),RPL4主要表達于惡性細胞和免疫細胞。RPL4在原發(fā)性結直腸癌患者的腫瘤微環(huán)境中廣泛表達于T細胞、B細胞、DC細胞等免疫細胞類型,但在上皮細胞表達較低。

2.3 RPL4在結直腸癌的GSEA富集分析 經GSEA分析發(fā)現(xiàn),在RPL4高表達組的結直腸癌患者中,在Hallmark基因集中主要在MYC和氧化磷酸化通路顯著富集(圖4a),在KEGG基因集中主要在DNA復制和細胞周期通路顯著富集,這些通路與腫瘤的生長、增殖密切相關(圖4b)。結果表明,RPL4可能在腫瘤進展中起一定作用。

2.4 結直腸癌中RPL4與藥物敏感性的相關性研究 對RPL4高、低表達組進行差異分析,比較組間的藥物的半數(shù)最大抑制濃度(IC50),結果顯示,用于治療腫瘤的貝利司他、帕博西尼和小分子XR-11576等8種藥物的IC50值在RPL4高表達組中顯著降低(P<0.05,圖5)。結果表明,結直腸癌中RPL4高表達預示著貝利司他和帕博西尼等藥物的治療效果較好。

2.5 RPL4在結直腸癌組織的表達情況 通過HPA數(shù)據(jù)庫提供的結直腸癌組織和正常組織中RPL4蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn),與正常結直腸組織比較,結直腸癌組織中RPL4的蛋白表達水平上調,并且主要位于基質細胞(圖6)。為了驗證RPL4的mRNA表達水平情況,進行qRT-RCR實驗,在結直腸癌組織中,RPL4的mRNA表達水平明顯高于正常組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖3 GSE166555中RPL4在13種主要細胞類型中的的表達水平

圖4 GSEA分析(a.高RPL4表達組和低RPL4表達組在Hallmark基因集中GSEA分析顯示的RPL4表達相關的顯著上調通路;b.高RPL4表達組和低RPL4表達組在KEGG基因集中GSEA分析顯示的RPL4表達相關的顯著上調通路)

圖5 RPL4高、低表達組抗腫瘤藥物半數(shù)最大抑制濃度比較[a.硝酸益康唑(Econazole nitrate);b.貝利司他(Belinostat);c.CUDC-305;d.雙氫青蒿素(Artenimol);e.帕博西尼(Palbociclib);f.青蒿素酯(Artesunate);g.XR-11576;h.人參皂苷(RH1)]

圖6 RPL4的免疫組化染色結果(a.正常結直腸組織;b.結直腸癌組織) 圖7 RPL4的qRT-PCR

3 討論

結直腸癌被認為是一種遺傳性疾病,腺瘤-癌序列是結直腸癌發(fā)展的基礎。目前,比較認可的靶向和免疫治療僅在有限的患者亞群中顯示出有效性[13]。由于這些原因,越來越需要定義個體患者的分子和生物學景觀,實現(xiàn)個體化治療極為迫切。本研究從多組學途徑發(fā)現(xiàn),RPL4是結直腸癌的預后生物標志物,可以有效地預測藥物治療療效。此外,本研究結果可以為進一步研究RPL4在結直腸癌進展機制中的潛在作用提供一些線索。

首先,本研究基于TCGA數(shù)據(jù)評估RPL4在結直腸癌中的表達水平,結果顯示,與正常結直腸組織比較,結直腸癌組織的RPL4表達水平明顯增加,配對差異分析也得到相同的結果,并且在單細胞測序水平上得到驗證。然后,本研究對結直腸組織進行了臨床樣本測試,qRT-PCR結果表明,RPL4在20個結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織,進一步驗證了RPL4在結直腸癌中的mRNA表達水平上調。在HPA數(shù)據(jù)庫中對RPL4在蛋白水平表達進行驗證,免疫組織化學結果顯示,RPL4在結直腸癌中的蛋白表達水平上調。上述研究結果表明,RPL4在結直腸癌中表達異常上調,導致癌細胞的生長和增殖,與不良預后相關。

本研究與RPL4相關的潛在藥物敏感性分析表明,硝酸益康唑、貝利司他、帕博西尼等對開發(fā)RPL4靶點治療方面顯示出巨大潛力。Weng等[14]研究發(fā)現(xiàn),硝酸益康唑是一種抗真菌化合物,在胰腺癌方面有較多研究,益康唑可作為自噬抑制劑抑制腫瘤生長,通過調節(jié)ATF3/ID-1/AKT軸刺激自噬啟動,同時破壞溶酶體生物發(fā)生,從而誘導胰腺導管腺癌細胞中過度的自噬體積累和ER應激介導的細胞凋亡。貝利司他是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑,在2014年經FDA認證用于治療復發(fā)或難治性外周T細胞淋巴瘤患者[15]。帕博西尼是CDK4/CDK6的抑制劑,一般與其他藥物聯(lián)合使用,治療激素受體呈陽性的晚期乳腺癌患者[16]。Sorokin等[17]臨床研究發(fā)現(xiàn),MEK抑制劑和CDK4/CDK6的抑制劑聯(lián)合使用可治療KRAS突變的結直腸癌患者,提高治療效果和安全性,并且揭示了靶向治療的耐藥機制。因此,本研究的結果和推導的假設可能為進一步深入研究提供一些線索。

綜上所述,核糖體基因RPL4有潛力成為用于結直腸癌診斷和預后評估的新型生物學標志物。本研究初步對RPL4在結直腸癌的表達水平、富集分析和藥物敏感性進行研究,表明其作為癌癥預后生物標志物的潛在功能及其有效預測藥物治療反應的潛在功能。雖然,本研究通過生物信息學分析確定了RPL4在結直腸癌中的潛在價值,但仍有不足,該項研究無法證明RPL4與這些預測藥物的直接相互作用。此外,本研究從在線數(shù)據(jù)庫中收集測序數(shù)據(jù)進行分析,這不可避免地存在一定的系統(tǒng)誤差。筆者認為,該項研究的進一步臨床應用和機理研究需要通過實驗進行證明。