夏雄飛,張凱強,任文來,韓長志,3

(1.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院,昆明 650224;2.文安縣農業(yè)農村局,河北 文安 065800;3.云南省森林災害預警與控制重點實驗室,昆明 650224)

【研究意義】近年來,小麥病害的發(fā)生給中國農業(yè)生產帶來了巨大的經濟損失,嚴重制約著中國小麥產業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展,威脅著國家糧食安全[1]。其中,白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)、葉枯病菌(Zymoseptoriatritici)、葉斑病菌(Parastagonosporanodorum)分別是引起小麥白粉病、葉枯病、葉斑病的病原真菌,其營養(yǎng)型分別為活體[2]、半活體[3]及死體營養(yǎng)型[4]。G蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptors, GPCR)蛋白廣泛存在于植物病原真菌中,在感知和傳遞外界信號方面發(fā)揮著重要功能。不同營養(yǎng)型病原真菌GPCR蛋白的數量及理化性質、遺傳關系等方面是否存在著同質性或差異性,對于進一步開發(fā)不同作用靶標的新型農藥具有重要的指導意義?！厩叭搜芯窟M展】GPCR蛋白廣泛存在于真核生物中,其主要功能在于接收信號源物質,并將信號源物質在受體中進一步“翻譯”后傳遞至下游信號鏈[5],具有典型的7重跨膜螺旋結構域[6],在植物病原真菌等生物的細胞增殖、分化、凋亡等生理生化反應中發(fā)揮重要作用[7],進而影響真菌的生長、分生孢子形成以及對植物的免疫應答等。前人多以單個小麥病原菌為對象開展次生代謝產物、效應子、分泌蛋白等致病因子以及遺傳關系的研究,如小麥葉斑病菌產生的聚酮化合物、非核糖體肽等次級代謝產物以及效應子在發(fā)病過程中的作用分析[8-9],小麥白粉病菌候選互作蛋白篩選[10]、遺傳多樣性分析[11],以及小麥葉枯病菌與小麥互作過程中的分泌蛋白情況分析[12]等。喻紅利等[13]前期通過TOPCONS、TMHMM、Philius等方法對禾谷炭疽菌的候選GPCR蛋白進行預測,明確該菌220個候選GPCR蛋白的理化性質及遺傳關系[14],該研究方法與前人利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)進行異源GPCR蛋白檢測分析相比[15],較好地實現了全部候選GPCR蛋白的高效預測。此外,祝友朋等[13]還對不同營養(yǎng)型植物病原真菌次生代謝產物合成基因簇進行了差異性研究。然而,關于小麥不同營養(yǎng)型病原真菌候選GPCR蛋白的生物信息比對分析尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】以小麥不同營養(yǎng)型病原真菌的蛋白序列為研究對象,利用3種不同的蛋白跨膜預測方法(TOPCONS、TMHMM、Philius)分析其含有的跨膜情況,通過篩選具有7重跨膜結構的蛋白,并結合SMART保守結構域分析其結構特征。同時,對所獲得的候選GPCR蛋白開展氨基酸序列長度、理論等電點、不穩(wěn)定系數、最強親(疏)水性氨基酸殘基情況、遺傳關系等分析。【擬解決的關鍵問題】基于生物信息分析的方法,明確小麥不同營養(yǎng)型病原真菌的候選GPCR蛋白理化性質差異性以及遺傳關系同質性特征,對于不同營養(yǎng)型病原真菌的候選GPCR蛋白受體-配體相互作用解析以及開發(fā)不同作用靶標的新型農藥具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 數據來源

小麥白粉病菌(登錄號:GCA_900519115.1)、葉枯病菌(登錄號:GCF_000219625.1)、葉斑病菌(登錄號:GCF_000146915.1)的蛋白序列來源于NCBI數據庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 試驗方法

1.2.1 找尋候選GPCR蛋白 基于多種在線預測軟件,首先,通過 TOPCONS (http://topcons.cbr.su.se/pred/)、TMHMM 2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.s/TMHMM-2.0/)以及Philius (http://www.yeastrc.org/philius/pages/philius/runPhilius.jsp)[13]分析小麥病原真菌全部蛋白的跨膜結構的情況;其次,通過 SignalP 5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)[17]分析信號肽;再次,通過SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)[18]預測保守結構域,剔除包含已證實功能的保守結構蛋白,保留不含任何已證實功能的蛋白(圖1),最終獲取3種病原真菌的候選GPCR蛋白。

A:典型候選GPCR蛋白;B:其他蛋白。

1.2.2 氨基酸理化性質情況分析 基于2種在線預測軟件,首先通過 Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)進行理論等電點和不穩(wěn)定系數分析;其后,通過 Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)預測最強親(疏)水性氨基酸情況[14]。

1.2.3 候選GPCR的遺傳關系分析 通過軟件MEGA 11.0進行多重比對分析并建立遺傳系統(tǒng)進化樹[19]。

1.3 數據統(tǒng)計

數據統(tǒng)計采用軟件Microsoft office 2019,圖表制作采用軟件Origin 2018、Adobe Photoshop 2019。

2 結果與分析

2.1 候選GPCR蛋白預測

基于TOPCONS、TMHMM、Philius 3種程序預測不同小麥病原真菌全部蛋白的跨膜情況,從表1可知,符合7重跨膜結構特性且不包含信號肽的蛋白數量的小麥白粉病菌為40～54個,平均為46個,占比為0.49%～0.65%;小麥葉枯病菌為82～97個,平均為90個,占比為0.75%～0.89%;小麥葉斑病菌為107～146個,平均為124個,占比為0.67%～0.91%。進一步通過SignalP 5.0對信號肽情況進行分析,明確小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌具有8重跨膜結構且包含信號肽的蛋白數量分別為2、3、10個。同時,利用SMART預測保守結構域,明確小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌具有候選GPCR蛋白數量分別為11、32、69個。小麥葉斑病菌的候選GPCR蛋白數量明顯高于其余2種病菌。

表1 3種小麥病原真菌的候選GPCR蛋白預測結果

2.2 氨基酸序列長度分析

通過對小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白氨基酸長度進行分析(圖2)。候選GPCR蛋白氨基酸序列長度分別為215～652、244～1028、236～563 aa,平均序列長度分別為407、399、383 aa。因此,小麥3種病原菌候選GPCR蛋白的氨基酸序列平均長度相近。

圖2 3種小麥病原真菌候選GPCR的序列長度比對

2.3 理論等電點與不穩(wěn)定系數分析

基于Protparam在線分析候選GPCR蛋白理論等電點與不穩(wěn)定系數。從圖3可見,小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的理論等電點分別為5.43～9.84、5.75～10.24、5.67～10.42,平均值分別為8.77、8.79、8.79。3種病菌各含有酸性蛋白質(理論等電點小于6.01)1、1、2個,占比分別為9.09%、3.13%、2.90%;堿性蛋白質(理論等電點大于8.00)9、27、57個,占比分別為81.89%、84.38%、82.61%。

圖3 3種小麥病原真菌候選GPCR氨基酸殘基的理論等電點與不穩(wěn)定系數的關系

同時,小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的不穩(wěn)定系數分別為18.68～56.69、21.71～68.43、25.47～56.80,平均值分別為41.07、40.05、39.59。3種病菌各含有不穩(wěn)定性蛋白(不穩(wěn)定系數高于40.01)7、13、31個,占比分別為36.36%、59.38%、55.07%,穩(wěn)定性蛋白(不穩(wěn)定系數低于40.01)4、19、38個,占比分別為63.64%、40.62%、44.93%。結果表明,小麥白粉病菌具有較多的酸性且穩(wěn)定蛋白,葉枯病菌具有較多的堿性且不穩(wěn)定蛋白。

2.4 最強親(疏)水性氨基酸殘基分布

基于Protscale在線分析候選GPCR蛋白最強親(疏)水性氨基酸殘基。從圖4可見,候選GPCR蛋白的最強親水性(親水性值小于0)氨基酸殘基小麥白粉病菌有9種,含量最高的為天冬氨酸和精氨酸,占比18.18%,其中異亮氨酸為其獨有;小麥葉枯病菌有12種,含量最高的為谷氨酸,占比21.62%;小麥葉斑病菌有16種,含量最高的為精氨酸,占比22.67%,且獨有纈氨酸、色氨酸、絡氨酸、苯丙氨酸。

A、B、C分別表示小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的氨基酸親水性殘基;a、b、c分別表示小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白的氨基酸疏水性殘基。

同時,候選GPCR蛋白的最強疏水性(親水性值大于0)氨基酸殘基小麥白粉病菌有5種,含量最高的為纈氨酸,占比38.46%;小麥葉枯病菌有10種,含量最高的為亮氨酸,占比28.57%;小麥葉斑病菌有12種,含量最高的為纈氨酸,占比24.66%,且獨有甲硫氨酸和甘氨酸。

2.5 親(疏)水性最值分析

基于Protscale在線分析候選GPCR蛋白的氨基酸親(疏)水性最值。從圖5可知,小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白氨基酸殘基親水性最值(小于0)分別為-0.722～-3.778、-1.478～-3.756、-1.544～-3.633,平均值分別為-2.680、-2.750、-2.730。

同時,小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌候選GPCR蛋白氨基酸殘基疏水性最值(大于0)分別為2.889～4.500、2.456～3.722、2.144～3.978,平均值分別為3.330、3.090、3.200。

2.6 遺傳關系分析

通過對小麥3種營養(yǎng)型病原真菌的112個候選GPCR蛋白序列進行遺傳關系分析。從圖6可知,3種病原真菌的候選GPCR蛋白明顯分為三大類,分別采用A、B、C進行區(qū)分。其中,在A類中共涉及71個候選GPCR蛋白,為最大的一類,包含小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白數量分別為6、19、46個;B類中則有36個候選GPCR蛋白,包含小麥白粉病菌、葉枯病菌、葉斑病菌的候選GPCR蛋白數量分別為3、12、21個;C類中則僅有數量較少的候選GPCR蛋白。就其功能而言,僅發(fā)現5個候選GPCR為假定蛋白(Hypothetical protein)。

A、B、C分別表示3個遺傳分支。

3 討 論

GPCR蛋白作為生物細胞中重要的信號傳遞受體,對維持生命的正常運轉發(fā)揮著重要作用,當前在醫(yī)療健康方面所應用的藥劑中有超過50%以該蛋白為作用靶標[20],未來以植物病原真菌的GPCR蛋白為靶標進行化學防控具有可行性。前人研究發(fā)現,致病疫霉(Phytophthorainfestans)的GPCR蛋白相關亞基Gγ參與孢子囊的發(fā)育和游動,其氨基酸序列與非卵菌Gγ亞基的整體相似性較低[21],說明不同物種編碼GPCR蛋白的氨基酸序列存在差異性,該發(fā)現與本研究中3種小麥病原真菌的候選GPCR蛋白及其理化性質存在一定差異性的分析結果相似。

此外,玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)作為活體營養(yǎng)型真菌,在堿性環(huán)境條件下侵染宿主時,其GPCR蛋白相關代謝途徑表達更加突出[22],而本研究中的小麥白粉病菌候選GPCR堿性蛋白占比較低,是否與pH適應過程有關,有待于今后進一步研究。稻瘟菌(Magnaportheoryzae)作為半活體營養(yǎng)型真菌,其GPCR相關蛋白PLG1可以促使病菌在疏水表面侵染宿主相比親水表面產生更多附著物[23],同樣,小麥葉枯病菌、白粉病菌、葉斑病菌的GPCR蛋白殘基親(疏)水性與病菌侵染識別之間是否存在關聯性,有待于進一步明確?；移咸焰?Botrytiscinerea)作為死體型真菌,其GPCR相關蛋白bmp1與上述稻瘟菌對于在親(疏)水表面的侵染表現相反[24],推測其GPCR蛋白氨基酸殘基種類的多樣性可能與其侵染識別相關。

4 結 論

小麥葉斑病菌的候選GPCR蛋白數量明顯高于其余2種病菌,白粉病菌則具有較多的酸性且穩(wěn)定蛋白,葉枯病菌具有較多的堿性且不穩(wěn)定蛋白。3種病菌的最強親(疏)水性氨基酸殘基的數量與種類均有較大差異。上述蛋白之間的親緣關系較近。本研究對不同營養(yǎng)型候選GPCR蛋白受體-配體相互作用解析以及開發(fā)不同作用靶標的新型農藥奠定理論基礎。