陳麗飛,劉云怡慧,李嘉峻,白 云,孟 緣,周蘊薇

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與草學(xué)學(xué)院,長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,長春 130118)

【研究意義】大苞萱草(Hemerocallismiddendorffii)隸屬阿?；?Asphodelaceae)萱草屬(Hemerocallis)多年生宿根草本植物,是我國北方優(yōu)良的露地宿根花卉[1-2]。因其花期較早,顏色以橘黃色為主,有“早金花”的美稱。大苞萱草花色艷麗且具有較強的抗旱能力,可作為優(yōu)良地被綠化及庭院觀賞植物。干旱作為非生物脅迫主要因素之一,持續(xù)的干旱不僅會導(dǎo)致植物的生長和發(fā)育停滯甚至死亡,還能使植物進行抗旱基因的表達,通過分子機制的調(diào)控表達出植株的抗旱性[3-5]。bHLH(Basic helix-loop-helix,堿性螺旋-環(huán)-螺旋)轉(zhuǎn)錄因子是廣泛存在于真核生物中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子,家族成員數(shù)量僅次于MYB家族,在生長發(fā)育、次生代謝和環(huán)境脅迫中均具有重要的調(diào)控作用。通過研究植物耐旱機制,篩選參與抵御干旱脅迫的相關(guān)基因,對推動提高植物抗旱性育種的發(fā)展起到重要作用?！厩叭搜芯窟M展】1989年,Eurre等[6]在小鼠肌肉發(fā)育的研究中首次發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子E12和E47,隨后在動物、植物及菌類在內(nèi)的所有真核生物中被鑒定及分離。bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域由約60個保守氨基酸殘基和2個保守基序組成,分為基本(Basic)區(qū)和螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)區(qū)[7-8],除保守結(jié)構(gòu)域外的其他序列具有較大差異?；緟^(qū)具有特定DNA序列結(jié)合活性特點,螺旋區(qū)域在蛋白質(zhì)相互作用中起作用,這種同時具備DNA和蛋白質(zhì)相互作用的特點,且大多數(shù)以形成二聚體的方式發(fā)揮其生物學(xué)功能,使得bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長調(diào)節(jié)等方面非常重要[9-11]。研究表明,擬南芥中大部分bHLH蛋白功能特征已被鑒定出來,包括參與植物形態(tài)建成、種子萌發(fā)、激素信號及應(yīng)激反應(yīng)[12-16]。不同植物中的bHLH基因家族成員數(shù)量各有不同,在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)、紅花(Carthamustinctorius)中分別發(fā)現(xiàn)bHLH家族成員167、178、141、41個[17-20],隨著bHLH基因家族成員功能研究的深入,越來越多的bHLH轉(zhuǎn)錄因子被證明與植物抵抗干旱脅迫有關(guān),如:OsbHLH148、OsbHLH120、GmbHLH125、EcbHLH57等轉(zhuǎn)錄因子。OsbHLH148能夠通過參與茉莉酸信號途徑對水稻的干旱耐受性起調(diào)節(jié)作用[21]。OsbHLH120可通過參與ABA信號通路,使植株在干旱脅迫下仍能保持一定的含水量,提高水稻的抗旱能力[22-23]。Zhai等[24]對小麥的研究中發(fā)現(xiàn),過表達TabHLH39可增強小麥的抗寒、抗旱和抗鹽能力。Dong等[25]對PebHLH35功能研究中發(fā)現(xiàn),該基因可增強胡楊的抗旱性?！颈狙芯壳腥朦c】由于目前對大苞萱草分子生物學(xué)方面的研究起步較晚,雖然bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物中的研究較為成熟,但是大苞萱草bHLH家族基因的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)方法對大苞萱草bHLH基因家族成員進行鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,通過對蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、表達模式的分析,為揭示bHLH轉(zhuǎn)錄因子在大苞萱草響應(yīng)干旱脅迫的過程中發(fā)揮一定作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與脅迫處理

供試材料為生長健壯的大苞萱草一年生幼苗,種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源圃。選取生長健壯、長勢一致的大苞萱草,定植于相同基質(zhì)(草炭∶珍珠巖=3∶1)的塑料花盆中進行為期35 d的緩苗工作。針對試驗材料進行脅迫處理:采用PEG-6000模擬干旱法,分為對照組(CK)和干旱脅迫組(20%PEG-6000),每個試驗組設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)4株,于同一時間澆入相同容量的超純水和20% PEG-6000溶液。干旱脅迫24 h后,采集試材新鮮的根尖(R)及嫩葉(L)并用錫箔紙包裝于液氮中速凍,隨后置于-80 ℃冰箱中保存,將樣品送至北京諾和致源科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 大苞萱草bHLH基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

在TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因序列及蛋白序列,利用本地BLAST和在線軟件Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行成員篩選,去除不含bHLH結(jié)構(gòu)域和重復(fù)的序列,得到具有bHLH保守域的大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子。利用在線軟件ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)獲得大苞萱草bHLH蛋白的理化性質(zhì),如氨基酸序列長度、相對分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)等電點等。利用網(wǎng)站CELLO V2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)對大苞萱草bHLH基因家族成員亞細胞定位進行預(yù)測。

1.3 大苞萱草bHLH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa-sopma.html)對大苞萱草bHLH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

1.4 大苞萱草bHLH基因家族保守基序分析及多重序列比對

通過在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)對大苞萱草bHLH蛋白保守基序進行搜索并使用TBtools軟件將大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守基序可視化。利用DNAMAN 6.0軟件對大苞萱草bHLH家族基因編碼的氨基酸序列進行多序列比對。

1.5 大苞萱草bHLH基因家族系統(tǒng)進化分析

以擬南芥作為參照,使用MEGA 7.0軟件對大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,采用鄰接(Neighbor-Joining method)法,Bootstrap值設(shè)置為1000,其他參數(shù)選擇默認值。使用在線軟件iTOL(https://itol.embl.de/)對系統(tǒng)發(fā)育樹進行美化處理。

1.6 大苞萱草bHLH基因家族在葉和根中的表達分析

利用北京諾禾致源科技股份有限公司提供的售后平臺工具NovoMagic(https://magic.novogene.com/customer/main#/login)分別制作葉和根中55個大苞萱草bHLH基因家族成員在處理組與對照組的表達模式熱聚圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大苞萱草bHLH基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

基于轉(zhuǎn)錄組測序得到232個大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子。利用在線軟件Smart和NCBI去除重復(fù)及不含有bHLH結(jié)構(gòu)的大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子,最終篩選得到55個大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子并命名為HmbHLH1～HmbHLH55。

55個大苞萱草bHLH基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)分析表明(表1),氨基酸序列長度最長和最短的基因分別為HmbHLH7和HmbHLH9,其肽鏈長度分別為824和100 aa,分子量分別為90.68和11.46 kD,平均氨基酸數(shù)為321.38 aa。平均親水指數(shù)均為負值且具有較強的親水性,是親水性蛋白。等電點的范圍為4.85～10.45,70.9%的HmbHLH家族蛋白的等電點小于7,屬于酸性蛋白。55個大苞萱草bHLH基因家族成員的亞細胞定位預(yù)測(表2)表明,共有33個HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子分布在細胞核內(nèi),21個HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子分布在葉綠體和線粒體中,僅有HmbHLH25位于細胞質(zhì)中。

表1 HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)

表2 HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子亞細胞定位

2.2 大苞萱草bHLH蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

如表3所示,55個HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白二級結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈以及無規(guī)卷曲,且HmbHLH蛋白均呈現(xiàn)出無規(guī)卷曲數(shù)>α-螺旋數(shù)≥延伸鏈數(shù)>β-折疊數(shù)的特點。

表3 HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白二級結(jié)構(gòu)

2.3 大苞萱草bHLH基因家族聚類分析

將鑒定得到的55個大苞萱草bHLH基因家族成員與161個擬南芥bHLH基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖1)。根據(jù)預(yù)測的HmbHLH蛋白保守基序包含種類的相似性,對其進行分類。綜合進化樹分類情況和AtbHLH轉(zhuǎn)錄因子的分類系統(tǒng),將HmbHLH基因家族成員分為11個亞家族。第6亞族成員數(shù)量最多,含有32個;第4亞族成員最少,含有5個。

2.4 大苞萱草bHLH家族蛋白保守基序(motif)分析及多重序列比對

55個大苞萱草bHLH蛋白序列的保守基序預(yù)測結(jié)果(圖2)表明,49個HmbHLH蛋白含有motif1,51個HmbHLH蛋白含有motif2,推測motif1和motif2是特征保守基序,共同構(gòu)成bHLH結(jié)構(gòu)域(圖3)。屬于同一亞組的bHLH轉(zhuǎn)錄因子有著相似的motif類型和數(shù)量,同時也存在差異,親緣關(guān)系較近的HmbHLH18和HmbHLH53包含motif種類和數(shù)量均相同,但近緣的HmbHLH55較以上2個蛋白少了motif14。在大苞萱草bHLH家族基因編碼蛋白中,HmbHLH9、HmbHLH16、HmbHLH35、HmbHLH44的motif類型最簡單且僅含有1種,HmbHLH18、HmbHLH53、HmbHLH55含有motif類型最多,為10種。

圖2 HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序

不同位點上的氨基酸字母的高度代表保守型的高低。

多重序列比對結(jié)果(圖4)表明,55個HmbHLH蛋白均具有典型的basic-helix-loop-helix(bHLH)保守結(jié)構(gòu)域,除loop區(qū),其他區(qū)域均具有相對保守的氨基酸位點。如圖5所示,在堿性區(qū)域(basic)中的氨基酸數(shù)量較少,第8和9位上具有高度保守的精氨酸。2個螺旋區(qū)中的第19和47位上具有高度保守的亮氨酸(L)。

圖4 HmbHLH結(jié)構(gòu)域的氨基酸比對

圖5 HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的保守結(jié)構(gòu)域

2.5 大苞萱草bHLH基因家族在葉和根中的表達分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)55個HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子在大苞萱草葉和根中具有不同的表達模式(圖6)。與對照組相比,處理組的葉中有上調(diào)基因26個,下調(diào)基因26個,其中HmbHLH24和HmbHLH26在葉中無表達,HmbHLH45處理前后的表達量不變,HmbHLH50、HmbHLH20、HmbHLH21、HmbHLH43明顯上調(diào),HmbHLH14、HmbHLH55明顯下調(diào)。處理組的根中有上調(diào)基因32個,下調(diào)基因22個,HmbHLH14在根中無表達,HmbHLH16、HmbHLH29明顯上調(diào),HmbHLH7、HmbHLH4、HmbHLH10明顯下調(diào)。在受到干旱脅迫后,大苞萱草葉中HmbHLH基因家族成員的表達量總體呈上升趨勢,根中HmbHLH基因家族成員的表達量總體呈下降趨勢。從55個HmbHLH基因家族成員中共篩選得到6個差異基因(圖7),葉中有4個差異基因,2個上調(diào)基因和2個下調(diào)基因;根中有2個差異基因,均為上調(diào)基因。

CL/CR為對照組,PL/PR為處理組,下同。

圖7 不同處理下葉(L)和根(R)中HmbHLH差異基因的韋恩圖

3 討 論

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能主要包括參與調(diào)節(jié)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及合成,如在干旱脅迫中參與調(diào)控植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮重要作用。研究表明,干旱脅迫下水稻OsbHLH148可通過參與調(diào)節(jié)茉莉酸信號途徑,來調(diào)節(jié)植株對干旱的耐受程度[21]。過表達PebHLH35基因會顯著降低擬南芥葉片的氣孔密度和開度,降低自身的蒸騰速率,從而維持干旱脅迫下植株的濕度,提高植物的抗旱能力[26]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以通過特定的氨基酸殘基與靶基因結(jié)合來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達,調(diào)控植物抗旱能力[27]。

本研究共鑒定出55個大苞萱草bHLH基因家族成員,通過對HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),有22個氨基酸殘基保守位點且保守性均超過50%,其中Leu-19氨基酸殘基完全保守。Atchley等[28-29]認為bHLH堿性區(qū)能夠辨別并結(jié)合靶DNA,螺旋區(qū)則在形成同源或異源二聚體方面發(fā)揮作用。由此,HmbHLH堿性區(qū)的特殊位點Glu-5、Arg-8和Arg-9可能在DNA結(jié)合中發(fā)揮重要作用,螺旋區(qū)的Leu-19和Leu-47高度保守,可能在形成二聚體中發(fā)揮作用。大苞萱草bHLH基因家族劃分為11個亞族,相同亞族的大苞萱草和擬南芥成員之間存在相似的基因結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能。擬南芥中第6亞族的轉(zhuǎn)錄因子,如AtbHLH4、AtbHLH5、AtbHLH6、AtbHLH17等可通過參與ABA合成、茉莉酸等激素信號途徑來提高植株抗逆性[30-31]。因此,同亞族的HmbHLH17、HmbHLH28、HmbHLH38等可能與大苞萱草的抗旱性相關(guān)。擬南芥中第10亞族的AtbHLH15和AtbHLH24能夠參與植物形態(tài)建成及種子萌發(fā),表明HmbHLH47和HmbHLH39可能在大苞萱草種子的萌發(fā)過程中發(fā)揮一定作用。

大苞萱草bHLH蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),同一亞家族大多數(shù)成員具有的保守基序種類和數(shù)量相似,表明每個亞家族編碼蛋白的功能相對穩(wěn)定。在大苞萱草bHLH蛋白中發(fā)現(xiàn)了20種保守基序,幾乎所有蛋白均包含motif1和motif2且基序motif1和motif2含有保守氨基酸精氨酸(R)和亮氨酸(L),推測motif1和motif2是大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守基序,共同構(gòu)成了bHLH結(jié)構(gòu)域,在HmbHLH基因行使功能時起重要作用。在植物的進化過程中亞組高度保守,相同的亞組蛋白保守基序相似。特定的亞組存在著特殊的基序,表明這些保守基序?qū)喿逄禺惖谋Ｊ毓δ芷鹬P(guān)鍵作用。大苞萱草bHLH蛋白保守基序的分析為bHLH基因的分類與進化提供了重要的參考依據(jù)。

在干旱脅迫下HmbHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達模式中,葉和根的基因表達均發(fā)生差異性變化。葉中有4個差異基因,分別為HmbHLH17、HmbHLH21、HmbHLH28和HmbHLH50,根中有2個差異基因,分別為HmbHLH16和HmbHLH29。經(jīng)干旱脅迫前后的對比發(fā)現(xiàn),葉中HmbHLH21和HmbHLH50的表達量均升高且HmbHLH50表達量變化顯著,HmbHLH17和HmbHLH28的表達量均下降。根中HmbHLH16和HmbHLH29的基因表達量均升高。Aftab等[32]研究發(fā)現(xiàn),干旱條件下過表達的AtbHLH106能有效減少氣孔開度來減少植株的水分蒸騰,以此來提高植株的抗旱能力。AtbHLH106轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合G-box和E-box順式作用元件,抑制下游逆境基因的表達進而增加ABA的積累,提高擬南芥的抗旱能力。通過本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹發(fā)現(xiàn),HmbHLH50與AtbHLH106具有較近的親緣關(guān)系,間接表明HmbHLH50可能通過促進其表達來參與大苞萱草響應(yīng)干旱脅迫的過程,但還需進一步驗證其生物學(xué)功能。

4 結(jié) 論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的逆境調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),共鑒定出55個大苞萱草bHLH基因家族成員并分為11個亞家族,HmbHLH蛋白的保守基序和理化性質(zhì)具有特異性和多樣性。通過對不同處理下葉和根中bHLH基因的表達分析,表明大苞萱草bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因可能與大苞萱草的抗旱性相關(guān),為深入研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子在大苞萱草響應(yīng)干旱脅迫過程中的生物學(xué)功能及分子機制提供理論基礎(chǔ)。