李聰聰，王浩乾，葉玙璠，陳瑤，任恒澤，李宇騰，郝心愿*，王新超，曹紅利，岳川*

1. 中國農業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農業(yè)農村部特種經濟動植物生物學與遺傳育種重點實驗室，浙江 杭州 310008；2. 福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；3. 西南大學食品科學學院，重慶 400715

茶樹（Camellia sinensis）是一種葉用經濟作物，春季萌發(fā)的新梢內含物豐富，是名優(yōu)茶最主要的加工原料。新梢發(fā)育過程受植株的內外因素影響，既關乎茶葉的產量和品質，也關乎茶葉的采收周期。目前有關茶葉新梢發(fā)育調控機理研究鮮有報道，植物激素在新梢發(fā)育中的作用和相關基因鑒定還有待深入研究。植物激素是植物體內產生的一些微量且在自身生理過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用的有機化合物，分別或協(xié)同調控植物的生長發(fā)育和分化[1]。激素在植物生長發(fā)育的不同階段發(fā)揮不同的作用，參與的主要生理過程包括種子的休眠和萌發(fā)[2]、果實的生長發(fā)育[3]以及植物的衰老[4]等。通過對低芽表型陸地棉和高芽表型突變體陸地棉腋芽進行轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，大量的差異表達基因與激素代謝和激素信號轉導有關[5]，表明內源激素是棉花腋芽生長的主要因素。研究表明，赤霉素（GA）[6]、脫落酸（ABA）[7]和吲哚-3-乙酸（IAA）[8]是參與腋芽生長調控的主要激素。GA 在多年生木本植物芽的萌發(fā)生長方面起著積極的調節(jié)作用；麻風樹、木瓜樹及其他一些植物進行GA 處理后，能夠顯著促進其側芽的生長[9]。缺乏ABA 生物合成基因的擬南芥突變體表現(xiàn)出分枝增加表型，表明ABA 是擬南芥腋芽生長的負調節(jié)劑[10]，同樣對ABA 敏感性降低的轉基因楊樹也表現(xiàn)出增強的分枝表型[11]。IAA 會抑制腋芽的激活[8]，是維持頂端優(yōu)勢的主要信號[12]。對完全不分枝的突變體杉木研究發(fā)現(xiàn)，在芽休眠解除期間，IAA 在突變體的頂端莖中積累，并通過細胞分裂素信號通路來增加ABA 的含量進而抑制腋芽的生長[13]。在茶樹新梢研究中發(fā)現(xiàn)，對茶樹外源噴施GA 和IAA 后，新梢生長量增加[14-15]，內源ABA 在茶樹新梢生長的過程中含量逐漸下降[14]。雖然ABA、GA 和IAA在茶樹新梢生長中的作用得到了初步證實，但是激素調控茶芽發(fā)育的分子機理仍不清楚。為明確不同激素影響茶樹新梢生長發(fā)育的主要通路和關鍵基因，本研究以參與植物生長發(fā)育調控的3 種主要激素ABA、GA3和IAA 為研究對象，在茶樹越冬芽萌動期進行外源激素噴施后，檢測分析處理新梢的表型變化和表達譜差異，擬揭示3 種激素在茶樹新梢發(fā)育中的主要作用和調控途徑，結合表達模式分析，深入挖掘參與新梢發(fā)育調控的關鍵基因，為闡明激素調控茶樹新梢發(fā)育的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2022 年3 月在中國農業(yè)科學院茶葉研究所國家茶樹改良中心進行。

1.1 試驗材料

選用龍井43 為供試品種，選擇栽培管理等同、長勢一致的自然越冬5 年生盆栽苗。

1.2 試驗處理

在越冬茶樹萌動期（2022 年3 月10 日），選用ABA（Simga A1049，美國）、GA3（BBI Life Sciences，德國）和 IAA（BBI Life Sciences，德國）3 種激素，分別稱取一定質量的ABA、GA3、IAA 分別溶于95%的酒精，再用純凈水定容，終濃度為100 μmol·L-1，對盆栽茶樹進行噴施處理，以純凈水為對照，處理當日早中晚噴施3 次，每次以液珠滴下為準。于處理后7 d 取茶樹腋芽用于轉錄組分析，每個處理設3 個生物學重復，所取樣品放入液氮速凍后-80 ℃保存。在處理后第7 天、第14天、第21 天時拍照鑒定表型并記錄。

1.3 總RNA 的提取

總RNA 的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，China），用超微量分光光度計（Nanodrop 2000c）檢測RNA 的濃度，利用Agilent 5400 片段分析儀一同來檢測RNA 的完整性。

1.4 轉錄組建庫及測序分析

樣品送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行建庫測序。建庫使用 NEBNext?Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒，使用Qubit2.0 Fluorometer 和Agilent 2100 bioanalyzer 進行構建文庫質量檢測，Illumina NovaSeq 6000 平臺測序。經過原始數(shù)據(jù)過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查，獲得高質量的序列數(shù)據(jù)（Clean reads）。

利用HISAT2 軟件將Clean reads 與參考基因組（茶樹龍井43 基因組）[16]進行比對，獲取Reads 在參考基因組上的定位信息。使用FeatureCounts v. 1.5.0-p3 計算每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的 fragments（FPKM值）。采用 DESeq2 來篩選差異表達基因（DEGs），差異基因分析首先對原始的readcount 進行標準化（Normalization），然后通過統(tǒng)計學模型進行假設檢驗概率（P-value）的計算，最后進行多重假設檢驗校正（BH），得到FDR 值（錯誤發(fā)現(xiàn)率）。差異基因的篩選條件為P-value≤0.05 且|log 2fold change|≥0。采用 clusterProfiler 軟件對差異基因集進行GO 功能富集分析，KEGG 通路富集分析。

1.5 基因表達檢測

為驗證轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性，對部分表達差異基因進行基因表達水平驗證，通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-bl ast）設計qRT-PCR 引物（表1）并用qRT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢驗引物設計的特異性。以茶樹為CsPTB作為內參基因[17]，熒光定量反應體系SYBR Mix（Takara）5.0 μL、cDNA 2 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各 1 μL，加水至終體積10 μL。每個樣品包含3 個生物學重復，2 個技術重復。充分混勻后進行短暫離心，于LightCycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR 儀上進行PCR 擴增，反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)45 次?；蛳鄬Ρ磉_量采用方法計算。

表1 熒光定量PCR 引物設計序列Table 1 Primer sequences of candidate genes used for real-time fluorescence quantitative PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析及作圖

使用Photoshop 進行新梢表型圖的排版和標注，Excel 進行數(shù)據(jù)處理及顯著性分析（t-test檢驗），NovoMagic 數(shù)據(jù)分析云平臺進行GO和KEGG 的圖片制作，Prism 6.0（GraphPad，美國）繪制基因表達圖。

2 結果與分析

2.1 3 種激素處理對茶樹新梢發(fā)育的表型影響

為探究 3 種激素對茶樹新梢生長發(fā)育的影響，對處于萌動期的茶樹進行外源噴施ABA、GA3和IAA 處理并檢測腋芽的長度，結果如圖1 和圖2 所示。外源ABA 處理抑制新梢萌發(fā)生長，與對照組相比，外源ABA 處理3 周內均可抑制茶樹新梢萌發(fā)生長，且抑制效果在處理第1 周時最顯著（圖1B，圖2）；GA3和IAA 處理對新梢萌發(fā)生長具有促進作用，外源GA3處理后3 周內均可促進茶樹新梢的生長，其中，前兩周內芽長都具有極顯著差異水平；外源IAA 處理后第2 周芽長極顯著伸長（圖1C，圖2）。

圖1 激素處理的芽萌發(fā)表型Fig. 1 The phenotype of sprouting buds after hormone treatments

圖2 激素處理后芽的長度Fig. 2 Bud length after hormone treatments

2.2 轉錄組數(shù)據(jù)分析

利用Illumina NovaSeq 6000 測序平臺對已經構建好的12 個cDNA 文庫進行測序，得到（4 158.7～4 990.1）萬條不同數(shù)目的原始序列。數(shù)據(jù)過濾后得到（4 016.7～4 937）萬條有效序列，過濾堿基數(shù)量在6.03G～7.1G，并且過濾序列Q20 在96.95%以上，Q30 在91.43%以上，整體錯誤率在0.03%，表明測序結果可靠，可用于后續(xù)分析（表2）。基于處理組與對照的3 種比較分析，獲得10 232 個差異表達基因（P-value≤0.05 且|log 2 fold change|≥0）。其中，GA3處理組的差異基因多于ABA 和IAA處理組的差異基因，3 種激素處理都是上調的差異基因數(shù)大于下調的差異基因數(shù)（圖3A）。

圖3 差異表達基因統(tǒng)計分析Fig. 3 Statistical analysis of differentially expressed genes

表2 轉錄組數(shù)據(jù)質量Table 2 The quality of the transcriptome data

2.3 差異表達基因GO 與KEGG 功能富集分析

為進一步分析預測差異基因的生物功能，對ABA vs CK、GA3vs CK 和IAA vs CK 3 組分別鑒定出的1 986、2 307 個和597 個獨有差異基因進行了GO 富集分析和KEGG 途徑分析（圖3B）。對于GO 和KEGG 功能富集分析，各選出富集程度最顯著的20 個條目進行展示。

2.3.1 ABA 處理的差異基因富集分析

GO 富集主要在細胞氨基酸代謝過程、α-氨基酸代謝過程、天冬氨酸家族氨基酸代謝過程、細胞氨基酸生物合成、含硫氨基酸生物合成、α-氨基酸生物合成、天冬氨酸家族氨基酸生物合成、色氨酸家族氨基酸生物合成以及多肽生物合成。對于KEGG 功能富集分析，最顯著富集的通路是氨基酸生物合成，這與GO功能富集分析一致（圖4）。

圖4 “ABA vs CK”差異表達基因的GO 與KEGG 通路分析Fig. 4 GO and KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of ‘ABA vs CK’

2.3.2 GA3處理的差異基因富集分析

GO 功能顯著富集主要有ATP 酶活性、與物質跨膜運動相結合的ATP 酶活性、與物質的運動相結合的ATP 酶活性、初級活性跨膜轉運體活性、p-p 鍵水解驅動的跨膜轉運蛋白活性、線粒體質子轉運ATP 合成復合物通路。對于KEGG 功能富集分析，顯著富集的通路有氧化磷酸化和光合作用中的相互作用，這與GO 功能富集分析一致（圖5）。

圖5 “GA vs CK”差異表達基因的GO 與KEGG 通路分析Fig. 5 GO and KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of ‘GA vs CK’

2.3.3 IAA 處理的差異基因富集分析

GO 功能顯著富集的主要有細胞分解代謝、氧化酸代謝、有機酸分解代謝和細胞氨基酸代謝。對于KEGG 功能分析，顯著富集的通路主要有類黃酮的生物合成（圖6）。

圖6 “IAA vs CK”差異表達基因的GO 與KEGG 通路分析Fig. 6 GO and KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of ‘IAA vs CK’

2.4 萌動芽響應激素的差異表達基因

2.4.1 植物激素信號轉導途徑及相關基因

ABA 激素處理茶樹萌動芽 7 d 后RNA-Seq 結果顯示，多個植物激素信號轉導途徑中的基因表達存在差異（圖7）。其中生長素信號通路響應最為顯著，生長素的輸入載體AUX1 編碼基因ChaUn7152.1 上調表達，Cha10g004610 下調表達。生長素早期響應因子SAUR 編碼的基因Cha13g005200、Cha08g018660上調表達，Cha06g001420 下調表達；Aux/IAA編碼基因Cha12g002960 上調表達；ARF 編碼基因Cha07g010980、Cha01g025320 均上調表達；GH3 編碼基因Cha11g001650、ChaUn5814.1、Cha05g009180 和Cha08g015920 上調表達，Cha08g015920 下調表達。

圖7 KEGG map 分析植物激素信號轉導相關的差異表達基因Fig. 7 KEGG map analysis of differentially expressed genes related to plant hormone signal transduction

在油菜素內酯信號通路中，受體激酶BAK1 編碼基因Cha02g013480 下調表達。類受體胞質激酶BSK3 編碼基因Cha02g018990、Cha09g000720 上調表達，ChaUn5480.11 下調表達。 周期蛋白 CYCD3 編碼的基因Cha01g019170 表達上調、Cha09g003380 下調表達。在水楊酸合成-降解途徑中，水楊酸受體NPR1 編碼基因Cha14g009990 上調表達、Cha07g000170 下調表達。轉錄因子TGA 編碼基因Cha11g003270 下調表達。在細胞分裂素信號轉導途徑中，磷酸轉運蛋白AHP 編碼基因Cha06g010480 上調表達，A-ARR 蛋白編碼基因Cha10g001940、ChaUn7487.1 下調表達。在茉莉酸信號通路中，關鍵的調節(jié)因子 JAZ編碼基因Cha15g011110 上調表達。在GA 信號通路中，關鍵成員蛋白 DELLA 編碼基因Cha14g012470（GAI）下調表達。在ABA 信號轉導途徑中，第二信使 PP2C 編碼基因Cha06g013790 下調表達。

2.4.2 光合作用信號轉導途徑及相關基因

光合作用信號通路中的光反應模塊中，富集于光系統(tǒng)Ⅱ中大量的差異表達基因均上調表達，其中包括PSBR 編碼基因Cha08g018420，PSBW 編碼基因Cha13g007540、Cha11g010980，PSBO 編碼基因Cha01g020400（PSBO1）、Cha03g016410（PSBO2）、PSBP 編碼基因Cha05g016390，PSBQ 編碼基因Chaun4943.2（PSBQ-2）。除了光系統(tǒng)Ⅱ的差異基因上調表達，光系統(tǒng)Ⅰ的差異基因也上調表達，其中包括PSAD 編碼基因Cha09g015530，PSAO編碼基因 Cha13g005990，LHCA 編碼基因Cha05g011790、Cha03g010840、Cha15g003570，PSAO 編碼基因Cha13g005990 均上調表達?？栁难h(huán)中 Cpn60beta2 編碼基因Cha01g023840、Cha13g009810 上調表達，RCA編碼基因Cha11g006560 上調表達，PTAC14編碼基因Cha07g000840 上調表達，果糖二磷酸醛縮酶 FBA 編碼基因 Cha02g017780、Cha10g008000 均上調表達。 萌發(fā)缺陷EMB3119 編碼基因Cha02g008250 上調表達，磷酸三酯異構酶TIM 編碼基因Cha02g018040上調表達。葉綠體中 2-磷酸甘油酸磷酸酶PGLP2 編碼基因 Cha07g015500，伴侶蛋白CPN60A 編碼基因Cha13g005110 上調表達，過氧化物酶體中羥基丙酮酸還原酶HPR 編碼基因Chaun10015.2、乙醇酸氧化酶GOX1 編碼基因Cha05g011660 和丙氨酸-2-氧戊二酸氨基轉移酶AOAT2 編碼基因Cha02g000210 均上調表達（圖8）。

圖8 MAPMAN 分析光合作用途徑相關的差異表達基因Fig. 8 Differentially expressed genes associated with photosynthetic pathways identified by MAPMAN analysis

2.4.3 類黃酮信號轉導途徑及相關基因

類黃酮生物合成信號通路中，木質素相關的差異基因全部上調表達，包括苯丙氨酸解氨酶 PAL 編碼基因 Cha08g005720 、Cha13g004970、Cha01g002680、Cha11g004750、Cha10g006940、Cha04g019190，肉桂酸-4-羥化酶C4H 編碼基因Cha04g013980，肉桂醇脫氫酶CAD 編碼基因Cha13g011050、Cha03g012950和CCR 編碼基因Cha03g007510。黃酮醇合成酶FSL 編碼基因Cha04g009620 上調表達，UDP-葡萄糖轉移酶編碼基因Cha04g012480、Cha12g011140、Cha12g001840、Cha02g015810、Cha04g021950、Cha06g015420、Chaun10809.1、Cha04g003460 上調表達，黃烷酮3-羥化酶F3H編碼基因Cha01g016660、Cha09g001340 上調表達。無色花青素還原酶 LAR 編碼基因Chaun10521.1、Cha03g011900、Cha09g002140、Chaun37508.1 均上調表達（圖9）。

圖9 MAPMAN 分析類黃酮生物合成相關的差異表達基因Fig. 9 Differentially expressed genes related to flavonoid biosynthesis identified by MAPMAN analysis

2.5 差異表達基因RT-qPCR 驗證

為了進一步驗證轉錄組數(shù)據(jù)的準確性，從3 個激素處理的各個轉錄組數(shù)據(jù)中選取了差異極顯著的8 個差異基因，分別是UGT71B6、GSTF2、MBD9、HB-7、PPCK1、PPC3、GSH1、GER3進行qRT-PCR 驗證。如圖10 所示，8個差異表達基因的熒光定量表達水平的變化與轉錄組基因豐度變化趨勢一致，進一步驗證了轉錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性。

圖10 8 個差異表達基因的表達水平驗證Fig. 10 Verification of the expression levels of 8 differentially expressed genes

3 討論

前人研究表明，外源噴施GA 能夠促進休眠解除，噴施ABA 能夠延遲芽萌發(fā)[2,18]。對草本植物綠豆的研究中，噴施ABA 顯著降低了株高，縮短了節(jié)間長度[19]。潘根生等[20]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹葉面噴施GA3后，新梢的生長量增大，生長速率加快。葉面噴施IAA 能夠促進F1 代苜蓿種子的萌發(fā)，其是通過調控萌發(fā)過程中內源激素ABA 和GA 的變化從而影響種子的萌發(fā)和生長[21]。本研究中，在茶芽處于萌動期時，噴施ABA 7 d 后觀察到顯著的芽抑制表型，噴施GA37 d 后觀察到明顯的芽生長促進表型。噴施激素14 d 的結果表明，茶樹對于外源激素的響應是一個短期的反應，ABA 處理對于新梢的抑制作用也會不斷地減弱。GA3處理的新梢中生長積極調節(jié)因子在不斷的積累，更加增強了新梢的發(fā)育。IAA 處理可能調控了芽萌發(fā)過程中內源激素GA 含量的增加從而影響芽萌發(fā)過程?？梢?，GA3和IAA 對春季茶芽萌發(fā)生長有正向的調控作用，ABA 的作用相反。

ABA 處理茶樹新梢中植物激素信號轉導通路GAI基因存在顯著差異表達。DELLA 蛋白作為植物特有的轉錄因子，在GA 信號轉導途徑中GA 主要通過降解此蛋白來調節(jié)植物的生長發(fā)育。擬南芥GAI 突變體對GA 信號不敏感，植株表現(xiàn)出不正常的矮化表型[22]。在煙草中過表達DkGAI2會出現(xiàn)植株矮化、節(jié)間縮短等表型，轉基因煙草植株中GA4的含量降低，說明DkGAI主要通過降低GA4的含量從而引起植株矮化[23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)GAI在ABA 處理7 d 下調表達。ABA 處理的茶芽中篩選到的GAI基因，可能是ABA 處理茶芽生長受到抑制的內部原因。

激素同樣參與植物的光合作用調控。研究表明，外源施用GA3能提升大豆植株的光合活性[24]。外源施用GA3還可以提高水稻葉片中葉綠素總量以及葉綠素a 的含量[25]。但是外源GA 施用對光合作用的調控機制目前還不清楚。本研究中，GA3處理的茶芽間距伸長，表現(xiàn)為生長促進性表型。GA3處理的茶芽中光合通路途徑中的大多數(shù)基因上調表達，其中，PSBO 蛋白是唯一放氧必需的外周蛋白，與PSBQ、PSBP 共同組成一個放氧復合體，以利于維持放氧反應的無機輔因子，是高等植物放氧所必須的[26]。光合作用通路中PSBO2、PSBQ-2 和PSBP-1基因的上調增強了茶芽的光合效率，促進了茶芽伸長。因此，GA3處理的茶樹可能通過加強光合作用為茶芽生長發(fā)育提供物質和能量支持。

激素對植物的次級代謝過程有著非常重要的影響。外源生長素施用能夠增強查爾酮合酶（CHS）蛋白表達以及總黃酮量，類黃酮物質直接影響生長素載體分布、含量和活性來調節(jié)生長素的活性運輸[27]。生長素含量與吲哚乙酸氧化酶活性呈負相關，某些類黃酮能通過控制此酶的活性，從而控制生長素的含量，最終影響植物的生長發(fā)育[28]。很多研究都證明植物的生長發(fā)育與類黃酮和生長素之前的相互作用有關，但是作用機理以及分子的調控機理仍需深入研究。本研究表明，IAA 處理的茶芽中類黃酮生物合成相關基因FLS1、F3H、CHIL、LDOX、C4H表達上調。結果還顯示，谷胱甘肽代謝通路的谷胱甘肽轉移酶GSTF2和GSTT1上調表達。有研究表明谷胱甘肽轉移酶可以促進類黃酮物質的生成[29]?？梢姴柩棵劝l(fā)過程中的類黃酮和谷胱甘肽轉移酶類物質代謝可能受IAA 信號調控，與茶芽的生長發(fā)育密切相關。新梢是茶樹生長發(fā)育最活躍的器官，類黃酮合成相關的基因在新梢發(fā)育過程中存在差異表達，但是這些基因是否參與新梢的生長發(fā)育還需要進一步的研究。

綜合分析表明，ABA 處理中的氨基酸生物合成通路、GA3處理中的氧化磷酸化通路和光合作用通路、IAA 處理中的類黃酮生物合成通路是參與茶樹新梢生長發(fā)育的重要通路，GAI、PSBO2、PSBQ-2和PSBP-1可能是參與新梢生長發(fā)育的關鍵基因。對這些基因功能的深入研究，將有助于茶樹新梢生長發(fā)育調控機理的全面揭示。