周晶輝，劉昌偉，張盛，許崗，胥偉，黃建安，劉仲華*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，湖南 長沙 410128；5. 醫(yī)藥工業(yè)用酶技術國家地方聯(lián)合工程研究中心湖南福來格生物技術有限公司，湖南 長沙 410100；6. 精制川茶四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000

茶黃素（Theaflavin，TFs）是紅茶中重要的色素，對紅茶風味品質(zhì)形成貢獻巨大[1]。在紅茶發(fā)酵過程中，不同類型的兒茶素（兒茶酚型和鄰苯三酚型）被多酚氧化酶（PPO：兒茶酚氧化酶；酪氨酸酶；漆酶）氧化形成鄰醌，鄰醌不穩(wěn)定，會自縮合和脫碳形成不同的 TFs（圖1）[2]。紅茶中主要的 TFs 是茶黃素（Theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin 3-O-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3′-沒食子酸酯（Theaflavin-3′-O-gallate，TF-3′-G）和茶黃素-3,3′-沒食子酸酯（Theaflavine-3,3'-digallate，TFDG）。

圖1 茶黃素的形成過程Fig. 1 Theaflavin formation process

大量研究表明，TFs 特別是TFDG，對人體許多方面具有健康功效。其中包括保護心肌細胞[3]，抑制癌細胞增殖[4-5]，發(fā)揮抗炎作用[6]，抗氧化作用[7]，預防骨質(zhì)疏松癥等[8]。由于TFs存在的藥用特性和健康益處，開發(fā)TFs 及其衍生物具有非常廣闊的商業(yè)前景。由于TFs 僅占紅茶干重的2%～6%[9]，直接從紅茶中提取成本高昂，而采用當代生物技術，開發(fā)固定化的多酚氧化酶重復多批次的酶促合成TFDG 是一種高效、經(jīng)濟且最具工業(yè)化應用前景的方法[10]。

交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）是荷蘭 Roger Shelldon 教授在2000 年提出的一種新型無載體固定化技術[11]。CLEAs 的制備分為以下幾步：首先，通過微生物發(fā)酵或組織提取獲得液態(tài)粗酶蛋白；其次，將沉淀劑（如硫酸銨、有機溶劑、非離子聚合物和其他沉淀劑）添加到含有酶的水溶液中，使酶蛋白通過非共價鍵形成超分子結(jié)構-不可溶的物理聚集體，從而產(chǎn)生粗酶聚合[12]；第三步，以戊二醛為交聯(lián)劑，將酶物理聚合體共價連接，形成CLEAs（圖2A），酶聚集體通過游離氨基與戊二醛的兩個醛基之間的共價鍵不可逆結(jié)合。

圖2 傳統(tǒng)交聯(lián)方法和酶交聯(lián)方法示意圖Fig. 2 Schematic diagram of traditional and enzymatic cross-linking methods

諸多研究表明，CLEAs 與游離酶相比具有更好的性能，如更高的催化活性，更好的熱穩(wěn)定性和可回收性等[13]。使用這種方法，已經(jīng)開發(fā)了多種CLEAs 的固定化酶，如用漆酶和酪氨酸酶結(jié)合形成CLEAs，能將廢水中的對乙酰氨基酚轉(zhuǎn)化為酚類化合物[14]；脂肪酶B的CLEAs 可以高效合成奧伐尼[15]；黑曲霉脂肪酶CLEAs 的制備，可增強其在有機溶劑和水溶劑中的活性[16]；酪氨酸酶CLEAs 在有機溶劑和離子液體中的活性和穩(wěn)定性都有明顯的提升[17]；此外，蘑菇酪氨酸酶CLEAs 被用作催化劑，可以以L-酪氨酸為底物制備L-3,4-二羥基苯丙氨酸（L-Dopa）[18]。上述傳統(tǒng)的CLEAs 制備方法都需要用到交聯(lián)試劑戊二醛，該化學試劑有毒且對環(huán)境不友好。兒茶素是茶葉中的一類天然產(chǎn)物，可與蛋白質(zhì)形成非共價和共價相互作用[14,19]（圖2B）。非共價相互作用包括氫鍵、疏水相互作用、范德華力和離子相互作用[20]。這些相互作用通常是可逆的，并且比共價相互作用弱[21]。共價鍵是指多酚在堿性條件下（pH＞9.0）或有氧存在的酶催化下容易氧化形成醌或半醌自由基。這些醌或半醌中間體很容易與蛋白質(zhì)的親核基團（如賴氨酸、半胱氨酸和色氨酸）發(fā)生反應[22]，并能在蛋白質(zhì)和多酚氧化產(chǎn)物之間形成共價交聯(lián)（C-N 或C-S）絡合物聚集體[19]。茶多酚與蛋白質(zhì)之間形成的共價鍵是通過席夫堿和邁克爾加成反應進行。因此，我們認為兒茶素可以作為天然交聯(lián)劑用于CLEAs 的制備。

本研究采用兒茶素作為蛋白交聯(lián)試劑，對CLEAs 制備的條件進行了優(yōu)化，并對CLEAs和游離酶的性質(zhì)進行了研究，以及對TFDG 的催化驗證，以期為茶黃素的工業(yè)化生產(chǎn)提供低成本和更高效的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有巨大芽孢桿菌來源的酪氨酸酶突變體[基因登錄號：MN509467.1，載體pET30a-Bmtyrc/BL21（DE3）]工程菌株為本實驗室前期構建保存[23]。本試驗中所用試劑均（分析純）采購自中國國藥集團有限公司。蛋白分離純化用試劑盒購買于QIAGEN 公司。兒茶素單體為湖南三福生物技術有限公司饋贈，純度98%以上的TFDG 標準品采購于阿拉丁試劑有限公司（上海）。

1.2 液態(tài)酶的制備與活性分析

從-80 ℃冰箱中取出酪氨酸酶突變體重組菌株劃線活化，按照文獻[23]中所述方法進行菌株的發(fā)酵、目的蛋白的表達與分離純化、蛋白濃度及其活性測定。其中酪氨酸酶的活性檢測參考文獻[24]方法并做了適當?shù)男薷?，具體的反應體系如下：反應底物用 0.1 mol·L-1pH 7.0 的磷酸緩沖液充分溶解1 mmol·L-1的L-Dopa（添加0.1 mmol·L-1Cu2+），在1.5 mL的EP 管中分別加入450 μL 的底物溶液和50 μL的酶溶液，輕微混勻后，于30 ℃反應5 min，然后加入 50 μL 20%的三氯乙酸溶液終止反應，12 000 r·min-1離心5 min，取適量上清液于475 nm 處進行OD 值檢測，以未加酶液的樣品作為空白對照。在上述條件下，以每分鐘吸光值變化為0.01 的數(shù)值定義為1 個單位。TFDG 的檢測方法參考文獻[23]中方法執(zhí)行。

1.3 酪氨酸酶交聯(lián)聚集體（CLEAs）的制備與參數(shù)優(yōu)化

選擇不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.5、1、2、4、6、8、10 mg·mL-1）的兒茶素（EC、ECG、EGC、EGCG）作為交聯(lián)劑進行CLEAs 的制備，酪氨酸酶的交聯(lián)反應在1.5 mL 的EP 管中進行，依次加入不同濃度的兒茶素溶液450 μL（pH 7.0 0.1 mol·L-1磷酸鹽配制），酪氨酸酶溶液50 μL（蛋白質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1，酶活力單位為100 U），迅速置于30 ℃條件下的搖床中，以轉(zhuǎn)速為120 r·min-1進行交聯(lián)反應60 min 后，12 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀，即得酪氨酸酶與多酚氧化產(chǎn)物交聯(lián)聚集體，用適量緩沖液洗滌2～3 次，以終質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的L-Dopa 溶液為底物測定活力并進行SDS-PAGE 電泳分析。選擇不同pH、溫度、交聯(lián)時間進行CLEAs 制備參數(shù)優(yōu)化，與傳統(tǒng)的蛋白沉淀試劑如硫酸銨，聚乙二醇進行對比，計算酶活回收率。

1.4 酶動力學參數(shù)分析

用0.1 mol·L-1pH 4.0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的兒茶素底物溶液（ECG 為0～8 mg·mL-1，EGCG 為0～16 mg·mL-1），添加相同酶活的CLEAs 和游離酪氨酸酶，于30 ℃反應5 min，測定相關數(shù)據(jù)，所有試驗設置3 個平行樣，利用Lineweaver-Burk 的方法作圖，計算出酶動力學常數(shù)。

1.5 CLEAs 的結(jié)構與催化性能

為了研究CLEAs 的形態(tài)結(jié)構特點，選擇EGCG 為對照樣品，以及在此基礎上制備的CLEAs 樣品為研究對象，將二者干燥后制備成粉末，在粉末上添加一層導電涂層，厚度約為2～3 nm，利用掃描電鏡（ZEISS Sigma 300德國）對CLEAs 進行形態(tài)學結(jié)構的觀察和分析，以未加酶的交聯(lián)劑EGCG 作為對照；進一步對CLEAs 進行傅立葉變換紅外吸收光譜FTIR 分析，考察交聯(lián)前后官能團的差異，利用紅外吸收光譜儀（Thermo Scientific Nicolet iS20 FT-IR）進行了光譜掃描分析（波長范圍：500～4 000 cm-1），以未加酶的交聯(lián)劑作為對照樣品。對CLEAs 和游離酶的催化特性進行研究，以L-Dopa 為底物，測定在不同條件下（乙醇耐受性、pH、熱穩(wěn)定性、底物耐受性）二者的催化性能。

1.6 CLEAs 與游離酶催化合成茶黃素TFDG

分別利用CLEAs 和游離酶進行催化合成茶黃素，底物EGCG 和ECG用15 mL 0.1 mol·L-1pH 4.0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液溶解，EGCG 和ECG 用量比為2∶1（4 mmol·L-1∶2 mmol·L-1），反應溫度30 ℃、pH 4.0、時間30 min，酪氨酸酶的活力為100 U。待反應結(jié)束后，離心取上清液進行TFDG 濃度測定，過濾后的固體重新加入底物溶液進行下一批次反應。反應以游離液態(tài)酶作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶交聯(lián)聚集體的最適條件

選擇不同兒茶素作為交聯(lián)試劑對酶的交聯(lián)情況進行測試，以酶交聯(lián)產(chǎn)率作為參考指標，從圖3 中可以看出，與傳統(tǒng)的固定化方法相比，利用EGCG 作為交聯(lián)反應的底物時，能獲得最大的酶活回收率（84.65%），其次為EC（84.55%），而采用傳統(tǒng)的硫酸銨沉淀和聚乙二醇（PEG）的方法，其酶活回收率分別為65.00%和74.41%（表1）。由此說明，選擇以兒茶素為底物進行酪氨酸酶的交聯(lián)比傳統(tǒng)沉淀（交聯(lián)）試劑方法具有優(yōu)越性，一方面省略了蛋白沉淀的步驟，另一方面兒茶素交聯(lián)的酶活回收率高。

表1 不同沉淀劑的酶活回收率對比Table 1 Comparison of enzyme activity recovery with different precipitators

圖3 不同兒茶素對酶交聯(lián)產(chǎn)率的影響Fig. 3 Effects of different catechins on enzyme cross-linking yield

通過對酪氨酸酶交聯(lián)的時間、pH、溫度條件的優(yōu)化，結(jié)果表明（圖4），交聯(lián)反應最佳條件為40 ℃，pH 7.0，反應時間50 min。

SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果表明（圖5），酪氨酸酶交聯(lián)前單體分子量為 35 kDa 左右（圖5A 和圖5B 泳道1），隨著交聯(lián)反應的進行，酪氨酸酶的分子量逐漸變大，且呈現(xiàn)不同大小的分子量表現(xiàn)出彌散的條帶，說明經(jīng)過交聯(lián)，酪氨酸酶形成了大小不一的復合物（圖5A 泳道2～7，圖5B 泳道2～3），且交聯(lián)后的蛋白大多數(shù)以不可溶的沉淀形式存在（圖5A泳道3）。

圖4 酪氨酸交聯(lián)酶聚集體制備參數(shù)條件優(yōu)化Fig. 4 Optimization of preparation parameters of tyrosine cross-linked enzyme aggregates

圖5 酶交聯(lián)產(chǎn)物的SDS-PAGE 電泳分析Fig. 5 Analysis of enzyme crosslinking products by SDS-PAGE electrophoresis

2.2 催化性能分析

通過對游離酶和CLEAs 的催化性能進行對比分析，從圖6A 中可看出，在偏酸性pH條件（pH＜6.0），交聯(lián)酶的催化活性相對游離酶而言，略有提升，更有利于茶黃素TFDG 的形成；溫度耐受性分析結(jié)果表明（圖6B），交聯(lián)酶和游離酶在溫度55 ℃以下表現(xiàn)穩(wěn)定，當溫度＞60 ℃時，游離酶的穩(wěn)定性急劇下降，65 ℃活力完全丟失，而交聯(lián)酶此時仍然保持有95%以上的催化活性，由此說明交聯(lián)酶相比游離酶具有較好的熱穩(wěn)定性，更適合于工業(yè)化應用；在有機溶劑耐受性方面（圖6C），可以看出當體系中乙醇體積濃度為60%左右時會對酶的催化性能有明顯提升，且交聯(lián)酶的催化性能提升要優(yōu)于游離酶，提升了約180%；在底物耐受性方面（圖6D），可以看出當反應體系中多酚溶液質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1時，會對游離酶和交聯(lián)酶的催化活性有明顯抑制作用，其對游離酶的活性抑制最大，殘留活性僅為25%左右，而此時交聯(lián)酶的殘留活性為60%以上，說明了交聯(lián)酶相比游離酶具有較好的底物耐受性。

圖6 游離酶和交聯(lián)酶的催化性能對比Fig. 6 Comparison of catalytic performance of free and cross-linked enzymes

游離酶和CLEAs 的動力學參數(shù)測定分析可以看出（表2），二者對底物EGCG 的km值相差不大，說明二者對底物EGCG 的親和性接近，而以ECG 為底物，游離酶的km值明顯高于交聯(lián)酶，說明交聯(lián)酶對底物ECG 具有較高的親和性，Vmax/km的分析表明CLEAs 的比值明顯高于游離酶，說明其具有較好的催化性能。

2.3 交聯(lián)酶的物理化學結(jié)構

為了研究交聯(lián)酶的物理化學結(jié)構的差異，以EGCG 和EGCG+酪氨酸酶交聯(lián)產(chǎn)物為研究對象，對二者分別進行了電鏡掃描（SEM）和傅里葉變換光譜（FTIR）分析。從交聯(lián)前EGCG的電鏡掃描圖可以看出，EGCG 的結(jié)構較為平滑（圖7A-C），而EGCG+酪氨酸酶交聯(lián)后產(chǎn)物結(jié)合能與EGCG 緊密結(jié)合形成交聯(lián)復合物，這可能是CLEAs 相比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性和更高的催化性能的原因。

圖7 EGCG 和EGCG+酪氨酸酶復合物的掃描電鏡圖Fig. 7 SEM view of EGCG and EGCG + tyrosinase complex

表2 游離酶和交聯(lián)酶的動力學參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of free and cross-linked enzymes

為了進一步研究底物EGCG 與酪氨酸酶交聯(lián)前后官能團的變化，分別對 EGCG 和EGCG+酪氨酸酶復合物進行傅里葉變換光譜分析，從圖8A 可以分析看出，EGCG 在3 500～3 750 cm-1，1 650～1 700 cm-1和1 600～1 650 cm-1處都有明顯的吸收峰，分別代表著-OH 的伸縮振動、-C=O 的伸縮振動，以及-C=C 的伸縮振動；當EGCG 與酪氨酸酶形成交聯(lián)復合物后，吸收峰的強度明顯減少，尤其是-OH 的伸縮振動變?nèi)?，說明交聯(lián)酶復合物的形成，導致EGCG 底物上的酚羥基明顯減少，交聯(lián)形成了更復雜的大分子結(jié)構（圖8B）。

圖8 EGCG 和EGCG+酪氨酸酶復合物（CLEAs）的FTIR 光譜分析Fig. 8 Analysis of EGCG and EGCG + tyrosinase complexes（CLEAs）by FTIR spectroscopy

2.4 交聯(lián)酶催化合成TFDG

通過對CLEAs 與游離酶的催化性能對比分析可知，交聯(lián)酶相比游離酶在熱穩(wěn)定性、底物耐受性、有機溶劑的耐受性等方面具有較好的優(yōu)勢，同時CLEAs 可以通過簡單地離心洗滌即可回收重復利用，降低工業(yè)化應用的成本。對CLEAs 催化合成TFDG 的能力進行評估，從圖9A 可以看出，CLEAs 催化合成TFDG具有較好的效果，第1 批次反應，體系中TFDG的質(zhì)量濃度可達800 μg·mL-1左右，且連續(xù)3個批次反應產(chǎn)物質(zhì)量濃度都＞700 μg·mL-1，說明前3 個批次的穩(wěn)定性非常好，隨著反應批次的增加，產(chǎn)物濃度呈逐漸下降的趨勢，分析原因一方面可能是由于多酚對酶具有抑制作用，另一方面可能是多酚、產(chǎn)物也容易與TFDG 形成更復雜的復合物，導致底物與酶的結(jié)合困難，活性降低。由圖9B 中可知，不同批次反應，體系中的顏色由深變淺，與TFDG 的產(chǎn)量具有相對應的關系。

圖9 酪氨酸酶交聯(lián)聚集體催化合成TFDG 產(chǎn)量Fig. 9 Yield of TFDG synthesis catalyzed by tyrosinase cross-linked aggregates

3 討論

游離酶應用于工業(yè)化主要的限制因素在于其只能使用1 批次，成本過高，通過技術改進實現(xiàn)酶的多批次重復利用是減少酶成本的重要途徑。固定化酶由于具有穩(wěn)定性好、回收率高可重復使用、催化活性高等優(yōu)點而被廣泛應用于工業(yè)生物催化中。在前期研究中，我們選擇了丙烯酸樹脂Eupergit C 作為酪氨酸酶的固定化載體進行了固定化研究，結(jié)果表明，用該樹脂可以成功將酪氨酸酶進行固定化，并進行了TFDG 的合成，但是該固定化酶使用1批次就丟失了大部分的活性，分析原因在于一方面產(chǎn)物茶黃素能與固定化酶顆粒形成緊密結(jié)合，形成了有顏色的復合物，阻塞了固定化酶的孔徑，影響了底物的進入導致了酶活性的丟失；另一方面固定化酪氨酶的活性可能會受到底物多酚的抑制作用，導致活性丟失。因此，該固定化方式制備的酪氨酸酶無法實現(xiàn)工業(yè)規(guī)?；瘧?，酶的多批次使用問題仍未得到有效解決。酶交聯(lián)聚集體是一種無載體的固定化技術，該技術路線可以分為兩個步驟，即酶的濃縮沉淀和酶的交聯(lián)?，F(xiàn)有報道中幾乎所有酶交聯(lián)聚集體的制備所用的交聯(lián)劑都需要戊二醛，且易被帶入下游產(chǎn)物，而戊二醛對人體具有毒性。因此開發(fā)環(huán)保、便捷、高效的酶交聯(lián)聚集體應用于茶黃素的合成具有十分重要的意義。

多酚化合物廣泛存在于植物中，可以通過共價和非共價的結(jié)合方式與蛋白質(zhì)進行結(jié)合從而改變蛋白結(jié)構，同時多酚與蛋白結(jié)合形成蛋白多酚復合物也可以影響蛋白的功能，如蛋白多酚結(jié)合復合物可以影響蛋白的二維和三維結(jié)構，導致氨基酸親水和疏水性的變化從而增加蛋白的可溶性；蛋白多酚復合物還能增加溶液的乳化作用，如研究表明大豆分離的蛋白和花青素形成的復合物能顯著提高溶液的乳化性能；此外，研究還表明沒食子酸對蛋白質(zhì)凝膠的性質(zhì)也有一定的影響，一定濃度的沒食子酸可以誘導蛋白質(zhì)聚集形成不溶性聚合物。由于酪氨酸酶是一種同時具有單酚酶和二酚酶活性的加氧酶，可以將茶多酚氧化成醌，然后自聚合形成絡合物?；诖耍狙芯窟x擇茶多酚作為酶蛋白交聯(lián)的底物。采用不同濃度、不同類型的多酚作為酪氨酸酶的交聯(lián)試劑。結(jié)果表明，底物EGCG 氧化產(chǎn)物具有較高的交聯(lián)回收率。這可能是因為EGCG 含有更多的酚羥基，可以更好地與酶蛋白分子交聯(lián)。通過交聯(lián)反應形成的CLEAs 在各種失活條件（有機溶劑、溫度、pH 和底物濃度）下表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。采用CLEAs 和游離酶（活性相同）催化合成TFDG，CLEAs 的產(chǎn)率明顯高于游離酶，且CLEAs 可連續(xù)5 批次反應，顯著降低了TFDG 的生產(chǎn)成本。

但是，用多酚作為交聯(lián)反應的底物也有一定的局限性。一方面，多酚能與蛋白質(zhì)形成絡合物，使蛋白質(zhì)結(jié)構發(fā)生變化，影響催化活性；另一方面，一定濃度的多酚對酶蛋白有較強的抑制作用，會導致酶活性的喪失。因此，利用多酚（氧化產(chǎn)物）進行酶蛋白交聯(lián)需要考慮以下因素：首先，需要針對特定的酶蛋白開發(fā)相應的交聯(lián)方法，不同酶蛋白與不同底物多酚的交聯(lián)效果可能不同，最佳反應條件有待探索；其次，有些酶蛋白可能不適合多酚作為交聯(lián)劑，因為多酚的存在會嚴重影響酶的活性；再次，多酚氧化產(chǎn)物的濃度需要定量檢測和分析，由于多酚氧化產(chǎn)物不穩(wěn)定，目前還沒有方便的檢測分析方法對其進行檢測和監(jiān)測。

基于此，未來可以從以下幾個方面進一步提升酶的使用效率：（1）可以選擇與載體共固定的CLEAs 制備，EGCG 作為交聯(lián)劑進行酶的交聯(lián)其機械穩(wěn)定性不高，多批次使用后容易被外界壓力或機械剪切力所破壞，導致活性損失，這也是多批次反應后TFDG 產(chǎn)率下降的原因，因此選擇穩(wěn)定的載體和CLEAs 相互結(jié)合的方法有望進一步提升酶的穩(wěn)定性和催化性能；（2）繼續(xù)對多酚氧化酶進行改造和篩選，進行以多酚為底物的酶耐受性、催化活性的篩選，提升酶的催化性能，最終獲得滿足工業(yè)化應用屬性的CLEAs。

本研究針對底物兒茶素的特性，創(chuàng)新性的利用兒茶素作為交聯(lián)試劑對酪氨酸酶進行了固定化，制備獲得了CLEAs，并應用于茶黃素-3,3′-雙沒食子酸酯的合成。交聯(lián)酶較游離酶表現(xiàn)出更優(yōu)異的催化性能（熱穩(wěn)定性、有機溶劑耐受性、底物耐受性）。交聯(lián)酶被用于合成茶黃素-3,3′-雙沒食子酸酯時，產(chǎn)物質(zhì)量濃度可達800 μg·mL-1，且交聯(lián)酶能被重復循環(huán)使用至少3 個批次，利用該方法制備茶黃素，可以顯著降低酶的應用成本，具有潛在工業(yè)化應用價值。