陳微　潘美紅　惠林沖　李威亞　郇國(guó)磊　何林玉　繆美華　陳振泰　楊海峰

摘要：bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝和逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)洋蔥基因家族成員進(jìn)行篩選和鑒定，并對(duì)家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)、保守基序、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)發(fā)育和蛋白互作生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)bHLH基因家族在洋蔥幼苗中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，從洋蔥轉(zhuǎn)錄組共鑒定到36個(gè)bHLH基因，預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)含有的氨基酸數(shù)量為127～610個(gè)，且均為親水性蛋白，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，洋蔥bHLH基因家族分為12個(gè)亞族，同一亞族的大多數(shù)基因具有相似的保守基序，大多數(shù)bHLH 基因在洋蔥幼苗中表達(dá)，不同基因的表達(dá)量水平差異較大。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究洋蔥bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：洋蔥；bHLH；轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S633.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）05-0011-08

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中重要的調(diào)節(jié)因子，可以與順式元件相互作用，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，來(lái)響應(yīng)環(huán)境脅迫。bHLH（ basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［1］，具有高度保守的 bHLH 結(jié)構(gòu)域，由大約50～60個(gè)保守氨基酸組成，包含2個(gè)功能區(qū)：一個(gè)是N端的堿性氨基酸區(qū)，長(zhǎng)度約為15個(gè)氨基酸，另一個(gè)是 HLH 區(qū)［2］。bHLH 蛋白調(diào)節(jié)許多生理過(guò)程，在黃酮類生物合成［3-4］、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］和植物生長(zhǎng)發(fā)育［6-8］等方面發(fā)揮著重要作用。

隨著不同物種全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的完成，多個(gè)物種中鑒定到bHLH 基因家族。目前，已從擬南芥［9］、毛竹［10］、胡蘿卜［11］、人參［12］、梨［13］、蘋果［14］、葡萄［15］等植物物種鑒定和分析了大量bHLH基因家族。隨著 bHLH 蛋白功能的確定，bHLH 的分類不斷得到改進(jìn)。根據(jù)序列相似性和進(jìn)化關(guān)系以及結(jié)合 DNA的能力，bHLH通常分為從A到F的6個(gè)主要組［16-17］。

洋蔥是全球范圍內(nèi)種植的蔬菜之一，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，很多國(guó)家視其為一種非常重要的蔬菜。迄今為止，bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究主要在擬南芥、葡萄、水稻等植物中，在洋蔥中未見bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能及理化性質(zhì)的報(bào)道。本研究利用洋蔥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)庫(kù)，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)bHLH基因家族進(jìn)行鑒定，并對(duì)其基本理化性質(zhì)、保守基序、蛋白互作、系統(tǒng)進(jìn)化以及基因表達(dá)情況等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，此外，還篩選到一些可能參與洋蔥黃酮生物合成途徑的bHLH基因，結(jié)果可為洋蔥AcbHLH基因功能的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗(yàn)所用的材料來(lái)自江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛基地，在苗期，選取長(zhǎng)勢(shì)相近的3株紫皮洋蔥和3株黃皮洋蔥，選取幼嫩鱗莖的表皮，液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序（轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已發(fā)表）。

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源及bHLH基因的鑒定

將測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭污染、低質(zhì)量、N比例大于5%的Reads，得到質(zhì)量較高的Clean Reads，利用Trinity軟件對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行混合組裝，共獲到77 474條Unigene［18］。分別從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù) （ https：//www.arabidopsis.org）和水稻數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/download/irgsp1.html）下載擬南芥bHLH家族蛋白序列和水稻bHLH家族蛋白序列。然后使用HMMER 3.0軟件對(duì)獲取的已知bHLH蛋白家族序列構(gòu)建隱馬爾可夫模型，以此模型搜尋洋蔥轉(zhuǎn)錄組所有編碼蛋白序列，找出洋蔥轉(zhuǎn)錄組蛋白序列中潛在的bHLH家族序列。使用BLASTP把洋蔥轉(zhuǎn)錄組所有蛋白的序列比對(duì)獲取的bHLH家族參考序列，e-value設(shè)為1e-10，比對(duì)上的序列用作候選的bHLH家族序列。

1.3 bHLH 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ExPASy-ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)洋蔥bHLH蛋白序列的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用MEME軟件（http：//meme.nbcr.net/meme）分析洋蔥bHLH家族的保守基序，保守基序的數(shù)目選擇15，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。利用ProtComp（http：//www.softberry.com/berry.phtml？topic=protcomppl&group=programs &subgroup=proloc）網(wǎng)站對(duì)洋蔥 bHLH家族成員的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 洋蔥bHLH 基因的系統(tǒng)發(fā)育

構(gòu)建方法：用MAFFT進(jìn)行多序列比對(duì)，然后用MEGA6.0軟件對(duì)鑒定得到的洋蔥、擬南芥的bHLH蛋白家族序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用鄰接法（neighbor-joining）和P-distance 模型構(gòu)建進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)置為重復(fù)1 000次。

1.5 洋蔥bHLH 蛋白功能聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)

利用 String 蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org/）分析洋蔥bHLH 蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，以模式植物擬南芥作為參考物種。

1.6 洋蔥bHLH 基因的表達(dá)分析

利用洋蔥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析bHLH基因的表達(dá)特征。以FPKM 值表示轉(zhuǎn)錄本豐度，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)均一化處理，利用Heml 工具做熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥bHLH 基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

為了從洋蔥轉(zhuǎn)錄組中獲得bHLH家族基因，使用擬南芥和水稻的bHLH蛋白序列進(jìn)行隱馬爾可夫模型和BLASTP搜索，對(duì)獲得的候選序列利用軟件pfamscan和Pfam A數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域注釋，確定將只含有保守結(jié)構(gòu)域bHLH 基序（PF00010）的序列作為最終的bHLH序列，最終獲得36個(gè)bHLH基因，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組編號(hào)順序?qū)⑵涿麨锳cbHLH1～AcbHLH36（表1）。

對(duì)洋蔥36 個(gè)bHLH基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析（表1），結(jié)果顯示，bHLH 基因編碼的氨基酸數(shù)目為127～610個(gè)，平均長(zhǎng)度為297個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量大小為14 718.73～66 957.14 u；等電點(diǎn)在4.84～9.44范圍內(nèi)。從整體看，有67%的洋蔥bHLH家族蛋白質(zhì)等電點(diǎn)小于7，等電點(diǎn)處于酸性范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子含有豐富的酸性氨基酸。蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果表明，洋蔥中36個(gè)bHLH家族蛋白總平均親水性均小于0，說(shuō)明該家族蛋白質(zhì)均屬于親水性蛋白質(zhì)，但是不同蛋白質(zhì)之間親水性存在差異。不穩(wěn)定指數(shù)在38.84～80.53之間，其中94.44%是不穩(wěn)定蛋白（Ⅱ>40），只有2個(gè)屬于穩(wěn)定蛋白（Ⅱ<40），脂肪系數(shù)介于55.70～94.32之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，AcbHLH1等27個(gè)蛋白定位于細(xì)胞核，其余的9個(gè)定位于細(xì)胞外。

2.2 洋蔥bHLH蛋白保守基序分析

洋蔥bHLH蛋白中的保守基序用在線軟件MEME分析（圖1），結(jié)果表明，36個(gè)bHLH基因家族成員中保守基序的數(shù)目及種類有差異，除AcbHLH5外， 所有的bHLH都含有基序motif 1和motif 2， 而且motif1和motif2 總是相鄰，二者共同構(gòu)成了bHLH 結(jié)構(gòu)域。9個(gè)成員含有motif 3，6個(gè)成員基序數(shù)目和構(gòu)成一樣，都是motif 1、motif 2 和motif 4，AcbHLH8、AcbHLH12、AcbHLH33和AcbHLH34含有7個(gè)基序，是基序最多的bHLH蛋白。

2.3 洋蔥bHLH 蛋白家族進(jìn)化關(guān)系分析

對(duì)擬南芥的bHLH蛋白序列和篩選的36條洋蔥bHLH蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。根據(jù)擬南芥中bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的分類系統(tǒng)和洋蔥bHLH轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹分類情況，36個(gè)bHLH可以劃分為12個(gè)亞族，其中數(shù)量最多的是H亞族，共13個(gè)，J亞族含有的bHLH數(shù)量次之，有9個(gè)，A、C、E和G亞族僅含有1個(gè)bHLH。

2.4 洋蔥bHLH蛋白互作關(guān)系

利用在線軟件STRING，預(yù)測(cè)洋蔥bHLH家族成員在擬南芥中同源蛋白的互作關(guān)系（圖3、圖4）。

結(jié)果顯示，洋蔥bHLH家族成員和多個(gè)蛋白相互作用。其中光敏色素互作蛋白PIL5和PIF3共同作用來(lái)調(diào)節(jié)光形態(tài)發(fā)生。

2.5 洋蔥bHLH基因家族表達(dá)分析

利用洋蔥（紫皮和黃皮）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，找到候選的 36個(gè)bHLH基因?qū)?yīng)轉(zhuǎn)錄本的RPKM 值，通過(guò)對(duì)RPKM 值取對(duì)數(shù)值轉(zhuǎn)換，利用Heml 熱圖軟件作熱圖（圖5）。結(jié)果顯示，36個(gè)bHLH基因在紫皮和黃皮洋蔥中展現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，AcbHLH7、AcbHLH32、AcbHLH33、AcbHLH22、AcbHLH6、AcbHLH35、AcbHLH5、AcbHLH19和AcbHLH26在紫皮洋蔥中的表達(dá)量較高。

3 討論與結(jié)論

作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，bHLH基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝以及應(yīng)對(duì)脅迫方面起著重要的作用?；谌蚪M研究的深入，越來(lái)越多物種的bHLH基因家族被陸續(xù)鑒定出來(lái)，其中擬南芥中鑒定出162個(gè)bHLH基因［19］，水稻中167個(gè)，番茄中152個(gè)［20］，葡萄中發(fā)現(xiàn)94個(gè)bHLH基因［15］，黃花蒿中鑒定出99個(gè)bHLH基因［21］，桃中有95個(gè)bHLH基因［22］，陳紅霖等從綠豆轉(zhuǎn)錄組中鑒定到122個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子［23］，Zhu等在龍血樹中發(fā)現(xiàn)了62個(gè)bHLH基因［24］。因?yàn)槿狈蚪M，目前尚未見洋蔥bHLH 基因家族鑒定及其功能分析的報(bào)道，本研究利用洋蔥幼苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)洋蔥中bHLH基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)AcbHLH基因家族中各蛋白的基本理化性質(zhì)、保守基序、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化、基因表達(dá)等方面進(jìn)行了分析，為bHLH基因家族成員在結(jié)構(gòu)和功能以及基因表達(dá)調(diào)控等方面的研究提供參考。

通過(guò)分析鑒定，去除冗余，在洋蔥中鑒定出36個(gè)bHLH基因家族成員，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組編號(hào)順序，將洋蔥36個(gè)bHLH基因分別命名為AcbHLH1～AcbHLH36。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組在洋蔥中鑒定到的bHLH蛋白數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于擬南芥、水稻和番茄中bHLH蛋白數(shù)量，這種情況可能與洋蔥基因組數(shù)據(jù)未獲得和轉(zhuǎn)錄組取樣時(shí)期有關(guān)，又或者測(cè)序組裝的條件限制有尚未發(fā)現(xiàn)的洋蔥bHLH基因家族成員。

洋蔥中36個(gè)bHLH基因的保守基序利用線軟件 MEME進(jìn)行分析，共找到15個(gè)高度保守基序，motif 1和motif 2 幾乎存在于所有的AcbHLH 蛋白中，它們總是彼此相鄰，共同構(gòu)成bHLH 結(jié)構(gòu)域，具有相似motif組成的洋蔥bHLH基因家族成員在聚類分析中距離較近，推測(cè)這些bHLH 保守基序在同一亞家族具有保守性及功能獨(dú)特性，而其他的保守基序也在每個(gè)亞家族發(fā)揮著不同的功能。

擬南芥和洋蔥bHLH蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明，36個(gè)bHLH劃分為12個(gè)亞族，而擬南芥、水稻中的bHLH蛋白被劃分為21、22個(gè)亞族［24-25］，由于目前對(duì)洋蔥bHLH蛋白的功能了解較少，無(wú)法更深入的分析其原因。

目前，對(duì)洋蔥bHLH基因家族的研究遠(yuǎn)不如擬南芥、水稻等植物深入，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子，在代謝和發(fā)育過(guò)程中起重要作用［26］。在擬南芥中已對(duì)大多數(shù)鑒定的 bHLH 蛋白進(jìn)行了功能鑒定。如轉(zhuǎn)錄因子PIF3 作為光感受器信號(hào)的直接光敏色素反應(yīng)伙伴，參與控制光調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［9］。花青素是類黃酮中最大的一類［27］，是最重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一。相關(guān)研究表明，MYB 和 WD40 轉(zhuǎn)錄因子可以與 bHLH 相互作用，參與花青素和黃酮醇的生物合成。bHLH2 和 bHLH46 在龍血樹中可能參與茉莉酸（JA）調(diào)節(jié)的黃酮類生物合成［28］。本研究中，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)共表達(dá)發(fā)現(xiàn)bHLH 轉(zhuǎn)錄因子PIF3與HY5相互作用，HY5在花青素的合成中具有一定的作用，因此，推測(cè)PIF3可能在洋蔥花青素的合成中起到一定的作用，但具體的作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

由于缺少基因組，目前在洋蔥分子生物學(xué)方面的研究相對(duì)滯后，未見洋蔥中bHLH 家族基因的報(bào)道，對(duì)該家族基因的功能和分類還缺乏系統(tǒng)深入的研究。本研究通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的洋蔥bHLH家族基因進(jìn)行鑒定，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化分析以及基因表達(dá)分析，為進(jìn)一步篩選洋蔥bHLH家族基因，揭示該家族基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2022-04-21

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號(hào)：CX（20）3164］；連云港市財(cái)政專項(xiàng)（編號(hào)：QNJJ2005）。

作者簡(jiǎn)介：陳 微（1990—），女，山東菏澤人，碩士，助理研究員，主要從事蔬菜育種和栽培研究。E-mail：1135050599@qq.com。

通信作者：楊海峰，副研究員，主要從事蔬菜育種和栽培研究。E-mail：13775492959@163.com。