王壹民 劉 強(qiáng)

動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的病理基礎(chǔ)，以不穩(wěn)定斑塊破裂或侵蝕導(dǎo)致的血栓栓塞事件是引起急性冠脈綜合征（ACS）的主要原因[1]。不穩(wěn)定斑塊包含以大壞死核心為特征的薄纖維帽粥樣硬化斑塊（TCFA）和侵蝕引起的糜爛斑塊[2-3]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于不穩(wěn)定斑塊動(dòng)物模型的研究報(bào)道較少，一般采用高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)斑塊形成，但該類模型很少自發(fā)斑塊破裂或侵蝕，不能很好地模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變進(jìn)程[4]。為系統(tǒng)研究不穩(wěn)定斑塊的病理生理特征及觀察藥物的干預(yù)效應(yīng)，有必要建立一個(gè)可重復(fù)性高，貼近臨床的不穩(wěn)定斑塊動(dòng)物模型。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

目前許多動(dòng)物模型已經(jīng)成熟地應(yīng)用到動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域中。小鼠因其繁殖迅速、易于遺傳操作以及能夠在合理時(shí)間范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生等特性，已成為研究動(dòng)脈粥樣硬化的主要物種[5]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)超過(guò)95%的動(dòng)脈粥樣硬化研究基于載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠或低密度脂蛋白受體基因敲除（LDLR-/-）小鼠，其中ApoE-/-小鼠應(yīng)用最為廣泛，約占研究總數(shù)的68.6%[6]。與LDLR-/-小鼠相比，ApoE-/-小鼠能更快地形成斑塊，并且具有更復(fù)雜多樣的表型[7]。因此，以ApoE-/-小鼠為基礎(chǔ)進(jìn)行基因操作或外科干預(yù)來(lái)構(gòu)建不穩(wěn)定斑塊模型的研究越來(lái)越多，本文回顧了近年常用的ApoE-/-小鼠不穩(wěn)定斑塊模型的造模方法、模型特點(diǎn)（見(jiàn)表1），為不穩(wěn)定斑塊模型小鼠的研究提供科學(xué)依據(jù)。

表1 常見(jiàn)不穩(wěn)定斑塊動(dòng)物模型特點(diǎn)

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的造模方法

2.1 右頸總動(dòng)脈串聯(lián)狹窄模型（TS 模型）TS 模型為ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)6 周后，部分結(jié)扎距離右頸總動(dòng)脈起始部1 mm 和4 mm 處血管，形成兩處直徑為150 μm 的串聯(lián)狹窄[8]。術(shù)后7 周在0～1 mm 處可觀察到典型薄纖維帽粥樣硬化斑塊特征，在4 mm遠(yuǎn)端則表現(xiàn)出穩(wěn)定斑塊特征。計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)（CFD）顯示TS 模型顯著降低了右側(cè)頸動(dòng)脈血流量（65%），由此在0～1 mm 處形成了較低壁面剪切應(yīng)力和較高拉伸應(yīng)力的局部環(huán)境。通過(guò)對(duì)比頸動(dòng)脈狹窄前后的斑塊組成成分，研究者發(fā)現(xiàn)在TS 模型中不穩(wěn)定斑塊比穩(wěn)定斑塊擁有更高比例的巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞，更大面積的脂質(zhì)核心，并且可以自發(fā)斑塊內(nèi)血管新生和斑塊破裂，腔內(nèi)血栓形成[9]。TS 模型可提供同一只小鼠不同斑塊類型的組織樣本，從而可以直接比較穩(wěn)定/不穩(wěn)定斑塊間的特征，以此探索不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療和診斷靶點(diǎn)，但不適用于斑塊鈣化及斑塊侵蝕方面的研究。

2.2 主動(dòng)脈縮窄模型（TAC 模型）TAC 模型是一種通過(guò)外科手術(shù)建立的頭臂干和左頸總動(dòng)脈之間的主動(dòng)脈狹窄構(gòu)建的壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的射血分?jǐn)?shù)降低性心衰小鼠模型[10]。Marino 等[11]對(duì)普通飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠進(jìn)行主動(dòng)脈縮窄術(shù)，引起近端主動(dòng)脈收縮壓、平均動(dòng)脈壓增高，術(shù)后8～25 周進(jìn)行跑步機(jī)試驗(yàn)，同時(shí)監(jiān)測(cè)心功能及心電圖表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)期間約有83%的小鼠死亡，心臟組織學(xué)分析顯示其中74%存在心梗證據(jù)，包括TCFA 破裂和斑塊侵蝕引起的血栓栓塞，以及運(yùn)動(dòng)相關(guān)的急性冠狀動(dòng)脈閉塞，后者表現(xiàn)為嚴(yán)重的心肌纖維化。該模型通過(guò)高脂血癥及高血壓雙危險(xiǎn)因子誘導(dǎo)小鼠冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊形成，與其他動(dòng)脈粥樣硬化模型相比，研究者直接觀察小鼠冠脈病變，并系統(tǒng)研究心臟相關(guān)終點(diǎn)事件，這更加符合人類冠心病的病變部位及心梗事件發(fā)生原因。適用于評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變形成和進(jìn)展的生物學(xué)研究。但該模型要求研究人員具備一定的手術(shù)操作技能和手術(shù)后監(jiān)測(cè)護(hù)理動(dòng)物的經(jīng)驗(yàn)。

2.3 左腎動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎模型（R+C 模型）部分結(jié)扎ApoE-/-小鼠左腎動(dòng)脈及左頸總動(dòng)脈，造成腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）持續(xù)激活和左頸總動(dòng)脈局部低振蕩剪切應(yīng)力環(huán)境，術(shù)后正常飼養(yǎng)8 周，即觀察到小鼠左頸總動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊表型，80%的小鼠自發(fā)斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂[12]。與之相比，頸動(dòng)脈部分結(jié)扎組小鼠的斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂發(fā)生率僅為10%，而腎動(dòng)脈部分結(jié)扎組小鼠未觀察到不穩(wěn)定斑塊表型。用氯沙坦治療R+C 模型小鼠后，可拮抗由RAAS 系統(tǒng)激活導(dǎo)致的血壓升高，并顯著降低斑塊內(nèi)出血、破裂發(fā)生率，由此證實(shí)內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ作為低剪切應(yīng)力下頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)展誘導(dǎo)因子的作用。R+C 模型模擬內(nèi)源性腎血管性高血壓及局部切應(yīng)力變化導(dǎo)致的不穩(wěn)定斑塊形成，但該模型未檢測(cè)斑塊內(nèi)新生血管形成，對(duì)斑塊內(nèi)出血的具體機(jī)制未作闡述。

2.4 左頸總動(dòng)脈電損傷及狹窄模型（Two Hit 模型）Franck 等[13]對(duì)正常飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈施加電流脈沖，術(shù)后4 周在損傷近端放置錐形套管，造成電損傷處低振蕩剪切應(yīng)力環(huán)境，這種先后兩次對(duì)同一動(dòng)脈段的損傷被稱為“Two Hit”。研究者發(fā)現(xiàn)，電損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞慢性激活及修復(fù)能力受損，并誘導(dǎo)富含平滑肌細(xì)胞和透明質(zhì)酸的內(nèi)膜增生，這種纖維內(nèi)膜幾乎沒(méi)有巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)核心，符合人類斑塊侵蝕的相關(guān)特征。放置套管后造成的血流紊亂環(huán)境促進(jìn)電損傷段管腔內(nèi)皮細(xì)胞脫落，Ly6G+中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及血小板活化，最終導(dǎo)致腔內(nèi)血栓形成。該模型通過(guò)纖維內(nèi)膜增生及血流紊亂環(huán)境引起斑塊侵蝕，是研究動(dòng)脈粥樣硬化斑塊侵蝕表型的全新方法。

2.5 ApoE-/-Fbn1C1039G+/-模型 原纖維蛋白-1（Fibrillin-1，F(xiàn)bn1）基因的突變會(huì)導(dǎo)致馬凡氏綜合征，這是一種以彈性纖維進(jìn)行性斷裂為特征的遺傳性疾病。Van 等[14]利用雜交技術(shù)獲得具有原纖維蛋白-1基因雜合點(diǎn)突變的載脂蛋白E 敲除小鼠。西方飲食喂養(yǎng)35 周，和ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-Fbn1C1039G+/-小鼠從第5 周開(kāi)始出現(xiàn)左室功能障礙，表現(xiàn)為舒張末期內(nèi)徑（EDD）、收縮末期內(nèi)徑（ESD）和心臟重量顯著增加。實(shí)驗(yàn)期間有70%的小鼠猝死，對(duì)所有小鼠心臟進(jìn)行組織學(xué)分析顯示，96%存在冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊和心肌梗死證據(jù)。ApoE-/-Fbn1C1039G+/-模型避免了機(jī)械損傷，但制備該基因修飾小鼠可能需要一定的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)猝死的高發(fā)生率可能會(huì)對(duì)研究造成限制。此外，60%以上的ApoE-/-Fbn1C1039G+/-小鼠表現(xiàn)出定向障礙、運(yùn)動(dòng)障礙等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，TTC染色顯示存在腦缺血損傷，提示中風(fēng)可能是小鼠的死亡原因之一，這些非心血管相關(guān)并發(fā)癥增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和潛在的混雜因素。

3 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)方法

3.1 斑塊成分分析 對(duì)斑塊內(nèi)部各組分的分析可以了解斑塊的性質(zhì)。Shiomi 等[15]提出，斑塊易損指數(shù)=脂質(zhì)成分（巨噬細(xì)胞+細(xì)胞外脂質(zhì)）/肌纖維成分（平滑肌細(xì)胞+膠原纖維），適用于整體上評(píng)價(jià)TCFA 的不穩(wěn)定性，但不適用于糜爛斑塊。安園園等[16]對(duì)該公式進(jìn)行改良，即斑塊易損指數(shù)=斑塊易損成分/纖維帽完整性，可以對(duì)兩類不穩(wěn)定斑塊進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，炎癥及免疫細(xì)胞在斑塊內(nèi)的分布也備受關(guān)注。Guo 等[17]發(fā)現(xiàn)，CD163+巨噬細(xì)胞通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的斑塊內(nèi)微血管生成促進(jìn)斑塊內(nèi)出血。Leistner 等[18]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)糜爛斑塊進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)部CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞選擇性富集。

3.2 炎癥指標(biāo) 不穩(wěn)定斑塊的炎癥相關(guān)生物標(biāo)志物主要有白細(xì)胞介素-1（IL-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等。IL-1 是一種被廣泛研究的炎性細(xì)胞因子，參與其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和血管壁內(nèi)炎性細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）的募集等。CANTOS 試驗(yàn)已證實(shí)在標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上，應(yīng)用卡納單抗（canakinumab）抑制IL-1β 能顯著降低心肌梗死患者的心血管事件復(fù)發(fā)率[19]。MCP-1 具有動(dòng)員單核細(xì)胞至斑塊內(nèi)的作用，Georgakis 等[20]在1199 例因頸動(dòng)脈狹窄接受動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的患者中發(fā)現(xiàn)，斑塊MCP-1 水平與不穩(wěn)定斑塊的組織病理學(xué)特征和分子標(biāo)記物相關(guān)，其中，既往有急性腦血管事件的患者斑塊MCP-1 水平顯著高于無(wú)癥狀斑塊患者。Zhao 等[21]使用無(wú)水乙醇灌洗右側(cè)頸總動(dòng)脈段聯(lián)合西式飲食建立不穩(wěn)定斑塊模型后發(fā)現(xiàn)，血清MCP-1 水平與斑塊易損性相關(guān)。MMP-9 過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定性。Seifert 等[22]對(duì)ApoE-/-小鼠右頸動(dòng)脈植入錐形套管改變其周?chē)鲃?dòng)力學(xué)，通過(guò)套管上游管腔低剪切應(yīng)力環(huán)境誘導(dǎo)不穩(wěn)定斑塊形成，相比之下套管下游病變呈現(xiàn)出穩(wěn)定斑塊特征，研究者發(fā)現(xiàn)在該模型中不穩(wěn)定斑塊的MMP-9 表達(dá)量顯著高于穩(wěn)定斑塊。

3.3 斑塊侵蝕、斑塊破裂和腔內(nèi)血栓形成 獲得病理切片后，對(duì)平滑肌細(xì)胞或Ⅰ型膠原進(jìn)行免疫學(xué)染色以定位纖維帽，判斷纖維帽的連續(xù)性及厚度。血栓表面標(biāo)志物（如CD41）及纖維帽的雙染則可在證實(shí)存在血栓的基礎(chǔ)上觀察血栓是否從管腔延伸到破裂斑塊內(nèi)部[11]。若連續(xù)切片染色顯示血栓位于管腔，鄰近斑塊但不在斑塊內(nèi)，且血栓附著斑塊處內(nèi)皮細(xì)胞核覆蓋缺失，或見(jiàn)纖維帽增厚，則可排除斑塊破裂，考慮是由斑塊侵蝕觸發(fā)腔內(nèi)血栓形成。此外，連續(xù)切片的內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞染色有助于證實(shí)破裂斑塊脫落。目前對(duì)不穩(wěn)定斑塊的解釋多為T(mén)CFA，最終導(dǎo)致斑塊破裂及血栓形成。而表面侵蝕的斑塊病理特征與TCFA 不同，該類斑塊缺乏脂質(zhì)及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，富含平滑肌細(xì)胞及Ⅲ型膠原，以內(nèi)皮細(xì)胞激活為起點(diǎn)，斑塊侵蝕逐漸導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，內(nèi)皮細(xì)胞死亡、脫落及壁血栓形成[23]。Franck 等[13]對(duì)ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈進(jìn)行電刺激造成內(nèi)膜損傷，4 周后在損傷近端動(dòng)脈放置袖帶，造成損傷處血流紊亂及振蕩壁面剪切應(yīng)力，模擬人斑塊侵蝕等相關(guān)病理過(guò)程。

3.4 斑塊內(nèi)新生血管和斑塊內(nèi)出血 斑塊內(nèi)局部缺氧及炎癥微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)外膜血管滋養(yǎng)管進(jìn)入內(nèi)膜，形成斑塊內(nèi)新生血管[24]。在定量計(jì)算時(shí)通過(guò)CD31 免疫學(xué)染色得出斑塊內(nèi)新生血管數(shù)量。CD31 和α-SMA 的雙染則可評(píng)估新生血管的成熟度，成熟血管表現(xiàn)為完全由平滑肌細(xì)胞覆蓋的單層內(nèi)皮細(xì)胞，而未成熟血管僅呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞層。對(duì)血小板的染色可以測(cè)定斑塊內(nèi)出血的程度。此外，在設(shè)計(jì)藥物對(duì)斑塊內(nèi)新生血管的影響實(shí)驗(yàn)中，研究者有時(shí)會(huì)加用基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)（Matrigel plug assay）以直接評(píng)估藥物對(duì)血管新生的作用[25]。

4 討論

在脂質(zhì)譜和脂蛋白代謝方面，小鼠的主要循環(huán)血脂是高密度脂蛋白（HDL），其血漿膽固醇的運(yùn)輸主要通過(guò)HDL 來(lái)完成。ApoE 是清除乳糜微粒和極低密度脂蛋白（VLDL）受體的配體，該基因的敲除導(dǎo)致血漿膽固醇以VLDL 的形式升高，而不是LDL。此外，ApoE 還參與合成細(xì)胞（主要是骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞系）的其他生物學(xué)功能[5，26]。在病變分布方面，小鼠動(dòng)脈粥樣硬化好發(fā)于主動(dòng)脈根部和頭臂動(dòng)脈、左頸動(dòng)脈、鎖骨下動(dòng)脈的分支點(diǎn)，這些病變部位并不是導(dǎo)致人類心血管疾病的主要區(qū)域，由于組織收集大小的限制，小鼠的冠脈病變并不容易被觀察到。盡管存在這些差異，轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)于我們理解動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制和潛在治療途徑仍是非常寶貴的[27]。

目前由TCFA 破裂導(dǎo)致ACS 的概念已得到廣泛接受，隨著他汀類藥物的普及，TCFA 可轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的形態(tài)特征，作為ACS 的另一種機(jī)制，纖維帽完整的糜爛斑塊導(dǎo)致的急性冠狀動(dòng)脈綜合征（IFC-ACS）逐漸引起關(guān)注。該類病變涉及內(nèi)皮完整性的破壞，在內(nèi)皮剝脫區(qū)域易形成血栓，而不破壞覆蓋在斑塊表面的纖維帽[28]。Leistner 等[18]通過(guò)光學(xué)相干斷層掃描（OCT）對(duì)170 例ACS 患者的冠脈罪犯病變分析發(fā)現(xiàn)，IFC-ACS 約占ACS 的三分之一，但其潛在的病理生理機(jī)制仍不明確。當(dāng)前所建立的臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)病變所多為T(mén)CFA，尚無(wú)被廣泛接受的模擬人類斑塊侵蝕的動(dòng)物模型，需要進(jìn)一步探索和研究。