張 偉 洪 洋 陳曉菲 王晨曄 丁彩飛

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的發(fā)生率達(dá)1%～5%[1]，是生殖健康領(lǐng)域的常見疾病。連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)2 次與3 次的病因構(gòu)成相似，且發(fā)生2 次自然流產(chǎn)后再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高[2]，因此將妊娠28 周之前，與同一配偶連續(xù)發(fā)生2 次及以上的自然流產(chǎn)定義為RSA，并推薦將反復(fù)生化妊娠納入RSA 進(jìn)行管理[3]。在妊娠過程中，T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）/半乳糖凝集素-9（Gal-9）信號通路調(diào)控母胎界面輔助性T 細(xì)胞1（Th1）/輔助性T 細(xì)胞2（Th2）及輔助性T 細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）之間的平衡以維持母胎免疫耐受[4]，RSA的發(fā)生與母胎之間的免疫耐受異常密切相關(guān)[5]。本研究應(yīng)用益腎安宮Ⅱ號對RSA 患者進(jìn)行干預(yù)，檢測外周血可溶性Tim-3（sTim-3）、Gal-9 的表達(dá)水平，探討益腎安宮Ⅱ號治療RSA 的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用益腎安宮Ⅱ號治療RSA 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步豐富RSA 的治療手段，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2020 年11 月至2022 年4 月就診于浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科的RSA患者60 例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組與對照組，每組30 例。選擇同時期就診的正常早孕期女性30 例為正常組。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核通過，審批號：[2020]研審第（41）號。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治專家共識》[6]相關(guān)內(nèi)容制定RSA 診斷標(biāo)準(zhǔn)：妊娠28 周前，自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生2 次及以上。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參考《中醫(yī)婦科學(xué)》[7]和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]中滑胎的相關(guān)內(nèi)容制定，符合脾腎兩虛型：屢孕屢墮連續(xù)2 次及以上，神疲乏力，頭暈耳鳴，腰膝酸軟，精神萎靡，氣短，納差，大便溏，夜尿頻數(shù)，面色萎黃或白，眼眶黯黑或有黯斑，肌膚不潤，舌質(zhì)淡嫩苔薄白，脈沉細(xì)滑，尺脈弱。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 RSA 組納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合西醫(yī)診斷及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；（2）自然流產(chǎn)2 次及2 次以上；（3）孕周＜12 周；（4）丈夫無精液異常；（5）夫妻雙方無染色體異常；（6）無解剖結(jié)構(gòu)異常；（7）無自身免疫性疾?。唬?）無內(nèi)分泌異常；（9）無感染因素；（10）無血凝分析異常。

1.3.2 正常組納入標(biāo)準(zhǔn)（1）既往正常足月分娩至少1 次且無自然流產(chǎn)史；（2）年齡與RSA 組相仿；（3）B 超提示宮內(nèi)早孕，可見心管搏動。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）生殖道畸形；（2）急慢性感染期；（3）男方精液異常；（4）自身免疫性疾病；（5）近期服用過免疫抑制劑；（6）合并有糖尿病、高血壓、心臟病、肝腎疾病及血液疾??；（7）有吸煙及酗酒史；（8）近3 個月內(nèi)有疫苗接種史；（9）未按規(guī)定服藥無法判斷療效，或資料不全影響療效判斷者。

2 方 法

2.1 治療方法 對照組口服地屈孕酮片（荷蘭蘇威制藥，批號H20020632）10 mg，每天3 次黃體支持治療，連續(xù)服用7 d 為1 個療程，直至孕12 周停藥。治療組加用益腎安宮Ⅱ號[鹽續(xù)斷、桑寄生、杜仲、炒黨參、熟地、炒白芍各15 g，菟絲子30 g，阿膠珠（烊兌）、茯苓、炒白術(shù)各12 g，甘草5 g]（杭州華東中藥飲片有限公司），水煎服，每天1 劑，分早晚溫服，連續(xù)服用7 d為1 個療程，直至孕12 周停藥。

2.2 檢測指標(biāo)及方法 治療組及對照組分別于治療前、孕12 周時采集靜脈血3 mL，正常組于首次就診時采集靜脈血3 mL，在小試管中自然凝血后收集血清，-80 ℃保存待用?；瘜W(xué)發(fā)光免疫法檢測血清孕酮（P）、雌二醇（E2）、人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測血清sTim-3、Gal-9 水平。

2.3 療效評定標(biāo)準(zhǔn) 參照《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治專家共識》[6]及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]的相關(guān)內(nèi)容修改制定：（1）治愈：妊娠超過28 周，孕28 周B 超示胎兒發(fā)育正常；（2）好轉(zhuǎn)：妊娠未超過28 周，但超過既往流產(chǎn)最大孕周，且既往流產(chǎn)孕周B 超示胚胎（胎兒）發(fā)育正常；（3）未愈：妊娠未超過既往流產(chǎn)最大孕周即發(fā)生流產(chǎn)，B 超檢查示胚胎發(fā)育不良或停止發(fā)育。總有效率=（治愈+好轉(zhuǎn)）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，治療前后比較采用配對樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三組研究對象一般資料比較 三組年齡、孕周比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 三組研究對象一般資料比較（）

表1 三組研究對象一般資料比較（）

注：治療組予達(dá)芙通聯(lián)合益腎安宮Ⅱ號口服；對照組予達(dá)芙通口服；正常組不予藥物治療

3.2 三組研究對象血清β-HCG、P、E2 水平比較治療前三組β-HCG、P、E2 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療組與對照組β-HCG、E2 水平較治療前顯著上升（P＜0.05），且治療組上升更明顯（P＜0.05）。治療組P 水平較治療前上升（P＜0.05），對照組P 水平治療前后無明顯改變（P＞0.05）。治療后，治療組與對照組P 水平相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組研究對象血清β-HCG、P、E2 水平比較（）

表2 三組研究對象血清β-HCG、P、E2 水平比較（）

注：治療組予達(dá)芙通聯(lián)合益腎安宮Ⅱ號口服；對照組予達(dá)芙通口服；正常組不予藥物治療；β-HCG 為β 人絨毛膜促性腺激素；P 為孕酮；E2 為雌二醇；與同組治療前比較，aP＜0.05；與對照組治療后比較，bP＜0.05

3.3 三組研究對象血清sTim-3、Gal-9 水平比較治療前，治療組與對照組sTim-3 水平無差異（P＞0.05），均明顯高于正常組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平無差異（P＞0.05），均明顯低于正常組（P＜0.05）。治療后，治療組與對照組sTim-3 水平均較治療前明顯下降（P＜0.05），且治療組明顯低于對照組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平均較治療前明顯上升（P＜0.05），且治療組明顯高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 三組研究對象血清sTim-3、Gal-9 水平比較（pg/mL，）

表3 三組研究對象血清sTim-3、Gal-9 水平比較（pg/mL，）

注：治療組予達(dá)芙通聯(lián)合益腎安宮Ⅱ號口服；對照組予達(dá)芙通口服；正常組不予藥物治療；sTim-3 為可溶性T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3；Gal-9 為半乳糖凝集素-9；與同組治療前比較，aP＜0.05；與對照組治療后比較，bP＜0.05；與正常組比較，cP＜0.05

3.4 兩組RSA 患者臨床療效比較 治療組總有效率93.33%，明顯高于對照組73.33%（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者臨床療效比較（例，%）

4 討論

RSA 病因復(fù)雜，包括遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染、凝血及免疫因素，其中免疫因素是目前RSA 研究的熱點(diǎn)問題[5]。妊娠過程類似半同種異體移植，母體免疫系統(tǒng)對胚胎攜帶的父方抗原產(chǎn)生免疫耐受是成功妊娠的關(guān)鍵，免疫耐受失衡會導(dǎo)致RSA[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg 及Th1/Th2 比例失衡導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)，從而誘發(fā)母胎免疫耐受失衡[10]。

RSA 在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“滑胎”“數(shù)墮胎”“屢孕屢墮”范疇。主要病機(jī)為脾腎兩虛、氣血不足，治療本病當(dāng)以“補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血”為法。益腎安宮Ⅱ號由壽胎丸合四君子湯化裁而來，方中鹽續(xù)斷、桑寄生、杜仲、菟絲子補(bǔ)腎益精，炒白術(shù)、炒黨參、茯苓益氣健脾，炒白芍養(yǎng)血斂陰，阿膠珠、熟地養(yǎng)陰補(bǔ)血，甘草調(diào)和諸藥。全方共奏健脾補(bǔ)腎、養(yǎng)血益氣、固沖安胎之效。研究結(jié)果表明，益腎安宮Ⅱ號可提高RSA 患者保胎治療效果，使RSA 患者外周血中Th17 細(xì)胞比例下降，Treg 細(xì)胞比例上升，Th17/Treg 失衡現(xiàn)象得以改善，有利于妊娠的維持[11]。本研究中，治療組總體有效率高于對照組（P＜0.05），提示益腎安宮Ⅱ號聯(lián)合地屈孕酮片治療RSA 療效明顯優(yōu)于單純使用地屈孕酮片。

β-HCG 在妊娠早期能維持妊娠黃體持續(xù)增長，刺激黃體分泌孕酮，避免著床的胚胎受到排斥，維持妊娠[12]。孕期E2 主要由卵巢及胎盤產(chǎn)生，隨著孕周呈遞增趨勢，其水平可作為早期胚胎發(fā)育標(biāo)志[13]。本研究結(jié)果顯示，治療后，治療組血清β-HCG 及E2 水平較治療前顯著上升（P＜0.05），且兩者水平顯著高于對照組（P＜0.05），提示益腎安宮Ⅱ號對RSA 患者血清β-HCG、E2 水平上升有促進(jìn)作用，可改善子宮及胎盤的血液循環(huán)，為胚胎的順利生長提供良好的內(nèi)環(huán)境，使妊娠得以繼續(xù)。

Tim-3 結(jié)合其配體Gal-9，產(chǎn)生抑制信號，誘導(dǎo)Th1 與Th17 細(xì)胞凋亡，負(fù)調(diào)節(jié)Th1 與Th17 細(xì)胞免疫應(yīng)答[14]。外周血和母胎界面淋巴細(xì)胞中Tim-3 表達(dá)上調(diào)，可抑制免疫反應(yīng)向Th1 偏移，維持體內(nèi)Th1/Th2 平衡，有益于成功妊娠[15]。Tim-3 抑制Th17 細(xì)胞分化，促進(jìn)Treg 細(xì)胞增殖[16]。上述研究提示，Tim-3-Gal-9 信號通路對維持T 細(xì)胞亞群的動態(tài)平衡起重要作用，有助于正常妊娠偏于Th2 與Treg 狀態(tài)，維持母胎界面免疫耐受，確保成功妊娠。Tim-3 可通過金屬蛋白酶從免疫細(xì)胞表面脫落，形成可sTim-3。相關(guān)研究表明，流產(chǎn)組外周血中sTim-3 的表達(dá)高于正常組[17-18]。推測其機(jī)制可能為Tim-3 在免疫細(xì)胞上的脫落，從而導(dǎo)致血清中sTim-3 的高表達(dá)。Lee 和Goverman[19]認(rèn)為，sTim-3 與Tim-3 可競爭性結(jié)合其共同配體Gal-9，且sTim-3 的結(jié)合力和作用效果要優(yōu)于Tim-3，可干擾Tim-3 與Gal-9 結(jié)合，削弱Tim-3-Gal-9 信號通路傳遞負(fù)性抑制信號，從而導(dǎo)致RSA的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，治療前治療組與對照組sTim-3 水平無差異（P＞0.05），均明顯高于正常組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平無差異（P＞0.05），均明顯低于正常組（P＜0.05）。提示RSA 患者血清sTim-3 水平明顯高于正常妊娠者，而Gal-9 水平明顯低于正常妊娠者。治療后治療組與對照組sTim-3水平均較治療前明顯下降（P＜0.05），且治療組明顯低于對照組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平均較治療前明顯上升（P＜0.05），且治療組明顯高于對照組（P＜0.05）。表明經(jīng)益腎安宮Ⅱ號干預(yù)后，RSA 患者血清sTim-3 水平下降，Gal-9 水平上升，減少sTim-3 競爭性結(jié)合Gal-9，解除sTim-3 對Tim-3-Gal-9 信號通路的干擾，調(diào)節(jié)和恢復(fù)Tim-3-Gal-9 信號通路介導(dǎo)的母胎免疫平衡，降低流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，有益于妊娠結(jié)局，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。