徐嘉韓 陸新剛

結(jié)直腸癌是常見且高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。2020 年全球新發(fā)結(jié)直腸癌病例超過188 萬例，居惡性腫瘤第三位[2]。結(jié)腸癌在中老年人群中發(fā)病率較高，已有超過直腸癌的趨勢[3]。目前結(jié)腸癌的治療策略是手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后輔助化療。隨著中醫(yī)藥在腫瘤領(lǐng)域的不斷發(fā)展，結(jié)腸癌手術(shù)聯(lián)合放化療期間適時介入中醫(yī)辨證施治，可減輕放化療毒副作用，提高手術(shù)療效[4]。雷公藤甲素作為傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要有效成分，是一種三環(huán)氧二萜內(nèi)酯類單體化合物，又名雷公藤內(nèi)酯醇[5]。相關(guān)研究表明，雷公藤甲素具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[6]。在腫瘤應(yīng)用領(lǐng)域，雷公藤甲素抗癌活性具有廣譜、高效的特點(diǎn)，可抑制包括宮頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、胰腺癌及前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長[7-8]。而目前雷公藤甲素對結(jié)腸癌的抗癌機(jī)制尚未十分明確，本研究通過探討雷公藤甲素抗結(jié)腸癌的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì) 胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 雷公藤甲素（批號HY-32735）購自美國MCE 公司；胎牛血清（批號16140089）、McCoy's 5A 培養(yǎng)基（批號16600082）購自美國賽默飛公司；丙二醛（MDA）試劑盒（批號JL-T0761）、Fe2+離子檢測試劑盒（批號JL-T1118）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量試劑盒（批號JL-T0906）均購自上海江萊生物；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）（批號M8650）購自北京索萊寶科技有限公司；一抗p53（批號2527S）、SLC7A11（批號98051S）、β-actin（批號4970S）抗體均購自美國CST 公司。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)（型號：Sorvall Legend Micro）、酶標(biāo)儀（型號：LabServ K3）購自美國賽默飛公司；電泳儀（型號：165-8033）、轉(zhuǎn)印槽（型號：170-3930）購自美國Bio-Rad 公司；熒光倒置顯微鏡（型號：TiS）購自日本尼康公司；流式細(xì)胞儀（CytoFlex S）超速離心機(jī)（Optima XPN-100）購自美國Beckman 庫爾特公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HCT116 細(xì)胞鋪于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用含10%胎牛血清的McCoy's 5A 培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。使用雷公藤甲素（0、1、2、5、10、20、40、80、160 nmol/L）干預(yù)HCT116細(xì)胞，分為對照組和雷公藤甲素組，每組設(shè)3 個復(fù)孔。

1.3 CCK-8 檢測 取對數(shù)生長期（80%細(xì)胞融合度）的HCT116 細(xì)胞接種于96 孔板中（5×103/孔），按實(shí)驗(yàn)方案干預(yù)后加入CCK-8 溶液，CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，去上清后加入二甲基亞砜（DMSO），最后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度。數(shù)據(jù)分析，HCT116 細(xì)胞活力（%）=（OD450實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（OD450對照組-空白組）×100%。

1.4 EdU 細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞接種于96 孔板中（5×103/孔）。采用胸腺嘧啶核苷類似物（EdU）試劑A 標(biāo)記細(xì)胞，孵育2～4 h 后在4%多聚甲醛中固定30 min，并用0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透10 min，最后在Apollo 染色反應(yīng)液中37 ℃避光條件下孵育30～60 min，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖活性。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HCT116 細(xì)胞，胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以500 個細(xì)胞/孔的密度接種于培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)到14 d 后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，拍照。

1.6 鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測 取對數(shù)生長期的HCT116 細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案干預(yù)細(xì)胞，根據(jù)生化檢測試劑盒說明書步驟，測定細(xì)胞中Fe2+、GSH、MDA含量。

1.7 ROS 檢測 2'，7'-二氫二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）法檢測ROS 水平。取對數(shù)生長期的HCT116 細(xì)胞，使用DCFH-DA 熒光探針標(biāo)記HCT116 細(xì)胞，DCFH 可被細(xì)胞中ROS 氧化生成熒光物質(zhì)2'，7'-二氯熒光素（DCF），應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測DCF 熒光強(qiáng)度。

1.8 線粒體膜電位檢測 配置JC-1 染色工作液，加入1 mL 工作液至6 孔板中，與鋪板細(xì)胞充分混勻，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot 檢測 使用RIPA（強(qiáng)效）裂解液裂解HCT116 細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行2-2-聯(lián)喹啉-4、4 二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量。蛋白經(jīng)過十二烷基？酸鈉-聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PDVF）膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后與一抗（p53，1 ∶1000，SLC7A11，1∶1000，β-actin，1∶1000，）在4 ℃搖床孵育過夜，最后與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗（1∶10000）反應(yīng)1 h，通過ECL 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影條帶。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 9.0 制作統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，若方差同質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方差不齊采用Tamhane's T2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素抑制HCT116 細(xì)胞活力 不同濃度雷公藤甲素處理HCT116 細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力成梯度依賴性降低（P＜0.05），見表1；其半抑制濃度（IC50）為47.82 nmol/L。

表1 不同濃度雷公藤甲素對HCT116 細(xì)胞活力的影響（%，）

表1 不同濃度雷公藤甲素對HCT116 細(xì)胞活力的影響（%，）

注：0，1，2，5，10，20，40，80，160nmol/L 為不同濃度雷公藤甲素干預(yù)24h；IC50=47.82 nmol/L；IC50 為半抑制濃度；與0 nmol/L 組比較，aP＜0.05

2.2 雷公藤甲素抑制HCT116 細(xì)胞增殖與克隆能力EdU 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素處理后，細(xì)胞增殖活性較對照組顯著降低（P＜0.05）（見圖1A）；同時平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，雷公藤甲素可顯著抑制HCT116 細(xì)胞克隆形成能力（P＜0.05），見圖1B。

圖1 HCT116 細(xì)胞增殖與克隆能力檢測

2.3 雷公藤甲素誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞鐵死亡 鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素處理后HCT116 細(xì)胞中Fe2+離子、MDA 水平升高，GSH 含量降低（P＜0.05）（見表2）；流式細(xì)胞術(shù)顯示，雷公藤甲素可顯著增加HCT116 細(xì)胞ROS 水平（P＜0.05），見圖2。

圖2 HCT116 細(xì)胞活性氧自由基ROS 水平檢測

表2 HCT116 細(xì)胞鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測（）

表2 HCT116 細(xì)胞鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測（）

注：對照組為常規(guī)條件培養(yǎng)24 h；雷公藤甲素組為40 nmol/L 雷公藤干預(yù)24 h；Fe2+為亞鐵離子；MDA 為丙二醛；GSH 為谷胱甘肽；與對照組比較，aP＜0.05

2.4 雷公藤甲素抑制HCT116 細(xì)胞線粒體膜電位細(xì)胞鐵死亡早期可出現(xiàn)線粒體膜電位下降，本研究采用JC-1 熒光探針檢測HCT116 細(xì)胞線粒體膜電位。在熒光顯微鏡下成功觀察到線粒體JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，證實(shí)雷公藤甲素可引起細(xì)胞線粒體膜電位下降。見圖3。

圖3 HCT116 細(xì)胞線粒體膜電位檢測（200X）

2.5 雷公藤甲素調(diào)控HCT116 細(xì)胞p53、SLC7A11蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，雷公藤甲素干預(yù)后HCT116 細(xì)胞p53 蛋白表達(dá)增加，SLC7A11 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Western blot 檢測HCT116 細(xì)胞p53、SLC7A11 蛋白表達(dá)注：對照組為常規(guī)條件培養(yǎng)24 h；雷公藤甲素組為40 nmol/L雷公藤干預(yù)24 h

3 討論

雷公藤甲素從1972 年首次分離以來，因其具備較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、抗炎和廣譜高效的抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性而備受關(guān)注[8]。隨著雷公藤甲素藥理學(xué)機(jī)制研究的深入，已證實(shí)它可通過調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡與自噬平衡、細(xì)胞遷移與侵襲、介導(dǎo)腫瘤免疫逃避等多種方式發(fā)揮抗癌作用[9]。本研究通過CCK-8 檢測發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可明顯抑制HCT116 細(xì)胞活力，且呈濃度梯度依賴性，其半抑制濃度IC50 為47.82 nmol/L。EdU 細(xì)胞增殖檢測與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了雷公藤甲素可抑制HCT116 細(xì)胞增殖克隆能力。

鐵死亡是一種在Fe2+離子參與下，因鐵依賴性ROS 的異常堆積而發(fā)生脂質(zhì)過氧化，最終引起細(xì)胞死亡的新型死亡方式[10]。細(xì)胞鐵死亡的形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)為線粒體皺縮、線粒體嵴減少或消失、線粒體外膜破裂及膜電位破壞[11]。相關(guān)研究顯示，鐵死亡參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡可抑制其持續(xù)激活的增殖信號，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，有望作為癌癥治療中的一個可以靶向的弱點(diǎn)[12]?；诖?，本研究推測雷公藤甲素可能可誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞鐵死亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖與克隆。通過鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷公藤甲素處理后，HCT116 細(xì)胞Fe2+離子、MDA 水平及ROS 水平顯著升高，GSH 含量降低；并通過JC-1 探針成功觀察到HCT116 細(xì)胞線粒體膜電位下降。

鐵死亡受到細(xì)胞內(nèi)多條信號通路嚴(yán)密調(diào)節(jié)，主要受到胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)體（System xc-）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的嚴(yán)格調(diào)控[13]。System xc-作為細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化體系，是由SLC7A11 和SLC3A2 組成的異二聚體，其中SLC7A11 亞基負(fù)責(zé)主要的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[14]。當(dāng)System xc-體系遭受破壞可引起胱氨酸吸收降低，影響GSH 的合成，最終導(dǎo)致GPX4 的失活和脂質(zhì)過氧化積累，從而促進(jìn)鐵死亡[15]。抑癌基因p53 可以通過抑制 SLC7A11 的表達(dá)來增強(qiáng)鐵死亡[16]。為進(jìn)一步詮釋雷公藤甲素誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制，本研究通過Western blot 實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，雷公藤甲素可上調(diào) HCT116 細(xì)胞p53 蛋白表達(dá)，從而抑制SLC7A11 蛋白豐度，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，雷公藤甲素可通過調(diào)控p53/SLC7A11 軸誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞鐵死亡，抑制腫瘤持續(xù)激活的增殖與克隆能力。本研究雖局限于體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相互佐證。