張存明 王軍衛(wèi) 陳 松 吳忠標 葉海波

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指持續(xù)或反復出現(xiàn)的無法達到和/或維持陰莖勃起完成性活動，而年齡是ED 最為重要的發(fā)病原因之一，ED發(fā)病率隨著年齡增長而升高[1]。ED 是最常見的男性性功能障礙，40～69 歲的男性患病率為61%，而70歲以上男性患病率則高達77%[2]。血管活性腸多肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）是非腎上腺素能非膽堿能抑制性神經(jīng)的重要遞質(zhì)，具有擴張血管、松弛平滑肌、抗炎等作用。前期研究表明，VIP 可以改善性腺功能障礙大鼠的勃起功能[3]。本研究通過延長飼養(yǎng)時間并進行勃起功能測試，構(gòu)建老齡模型ED 大鼠，探討VIP 對老齡模型ED 大鼠的治療作用及其機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 級雄性SD 大鼠40 只，6 月齡，體質(zhì)量300～320 g。購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2019-0005，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證SYXK（浙）2019-0098。本實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學動物管理與倫理委員會審核通過。動物飼養(yǎng)：溫度（20±2）℃，濕度55%，照明/黑夜：12 h/12 h，自由飲食、飲水的環(huán)境。

1.2 藥品和試劑 阿撲嗎啡（B6936，批號ZJK-0921）購自ApexBio Technology；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012S，批號198273）、極超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（P0018FS，批號238924）、RIPA 裂解液（P0013K，批號938475）購自上海碧云天生物公司；環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）（H164，批號KD-3944）、一氧化氮（NO）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（A012-1-2，批號20219434），均購自南京建成生物有限公司；VIP 購自Sigma 公司（V0131，批號SE-62344）；蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）（ab75991，批號D-1892）、內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）（ab300071，批號D-8823）、血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）（ab6994，批號D90287）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）（ab214424，批號D0938），均購自英國Abcam 公司；HRP 羊抗鼠二抗（RS0002，批號R2903-2）、β-actin 兔抗大鼠單克隆抗體（YM3028，批號KL20384-8），購自北京Immunoway 公司。

1.3 儀 器 信息化生物信號采集與處理儀器（泰盟BL-420N），Olympus 正置圖文采集系統(tǒng)顯微鏡（BX53M），微量高速冷凍離心機（M1324R），蛋白垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司），F(xiàn)luor chem R 成像儀（Protein Simple 公司），脫水機、組織蠟塊切片機（美國Thermo Scientific 公司，HM340E）。

2 實驗方法

2.1 模型建立及分組處理 將40 只SD 大鼠飼養(yǎng)至18 個月齡，使用阿撲嗎啡進行勃起誘導實驗，陰莖頭充血及末端陰莖出現(xiàn)記為1 次勃起，勃起次數(shù)≥1 次為陽性，勃起次數(shù)為0 分為ED 大鼠[4]。將篩選出的21 只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為老齡勃起功能正常大鼠組（正常組）、老齡ED 大鼠組（ED 組）和老齡ED 大鼠藥物干預組（干預組），干預組大鼠使用VIP 25 ng/kg 隔日腹腔注射，治療28 d[5]。

2.2 海綿體內(nèi)壓及平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）測定 所有大鼠用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后沿腹正中線切口切開，使用顯微器械暴露走形往陰莖方向的腹側(cè)海綿體神經(jīng)進行電刺激，電刺激參數(shù)設定為：頻率20 Hz，寬度5 ms，電壓5 v，持續(xù)60 s，間隔休息時間5 min。同時將連接生理信號采集處理系統(tǒng)的22 號紫色輸液針置入陰莖海綿體內(nèi)，暴露同側(cè)頸動脈置入PE-50 管以監(jiān)測MAP[6]。

2.3 組織免疫熒光染色法檢測大鼠陰莖海綿體vWF 表達 機能實驗結(jié)束后獲取的陰莖海綿體組織用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋后切成5 μm 切片，脫蠟及乙醇脫水，枸櫞酸鈉進行抗原修復后使用10%山羊血清37%濕盒內(nèi)封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗在37 ℃避光孵育1 h，加入DAPI 染色液室溫避光孵育10 min。防熒光淬滅封片劑封片后使用熒光顯微鏡觀察并記錄。

2.4 ELISA 法檢測海綿體組織cAMP 和NO 含量大鼠陰莖組織獲取后置于-80 ℃冰箱備用，臨用時在組織中加入9 倍體積的磷酸鹽緩沖溶液，勻漿后5000 r/min 離心15 min，獲取的上清液按試劑盒說明書操作，測定cAMP 和NO 含量。

2.5 蛋白印跡法檢測陰莖海綿體組織PKA、eNOS、vWF 及VEGF 蛋白表達 大鼠陰莖海綿體組織粉碎后加入蛋白裂解試劑提取組織總蛋白，使用BCA 試劑進行蛋白定量后將樣品與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1 在冰上配置混合液體混勻后于100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，冷卻后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。后續(xù)實驗室時將等量蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠上樣孔內(nèi)，以110 V 的恒壓電泳，當溴酚藍進入底部后進行轉(zhuǎn)膜操作，以300 mA 電流轉(zhuǎn)膜80 min 至聚偏二氟乙烯（PVDF）印跡膜。PVDF 膜5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗（PKA、eNOS、vWF、VEGF、β-actin 1∶1000）4 ℃孵育過夜，相應二抗室溫下?lián)u床孵育2 h 后使用ECL發(fā)光液，使用Image J 分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，分析各目的蛋白相對表達水平。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 軟件分析所得數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，方差齊的數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（one-way ANVOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組老齡大鼠勃起功能比較 正常組、ED 組及干預組大鼠各組間基礎ICP、MAP 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，ED 組Max ICP 與Max ICP/MAP 明顯降低（P＜0.01）；與ED 組比較，干預組Max ICP、Max ICP/MAP 增高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 各組老齡大鼠勃起功能比較（）

表1 各組老齡大鼠勃起功能比較（）

注：正常組為老齡勃起功能正常大鼠；ED 組為老齡勃起功能障礙大鼠；干預組為老齡勃起功能障礙大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射；Base ICP 為基礎陰莖海綿體內(nèi)壓；Max ICP 為陰莖海綿體內(nèi)壓最大值；MAP 為平均動脈壓；1 mmHg=0.133 kPa；與正常組比較，aP＜0.01；與ED 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.2 各組小鼠陰莖海綿體組織vWF 表達比較 免疫熒光結(jié)果顯示，正常組紅色熒光表達明亮，ED 組與正常組比較，紅色熒光明顯減弱。干預組與ED 組比較，紅色熒光明顯增加。同時ED 組中，海綿竇充血間隙空間減少，而VIP 治療后間隙增加，見圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組大鼠陰莖海綿體組織vWF 蛋白熒光強度表達（×100）

3.3 各組大鼠陰莖海綿體組織cAMP 和NO 表達量比較 與正常組比較，ED 組大鼠陰莖海綿體組織上清液cAMP 與NO 含量降低（P 均＜0.05）。與ED 組比較，干預組cAMP 明顯升高（P＜0.01），同時NO 升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠陰莖海綿體cAMP 和NO 表達水平比較（）

表2 各組大鼠陰莖海綿體cAMP 和NO 表達水平比較（）

注：正常組為老齡勃起功能正常大鼠；ED 組為老齡ED 大鼠；干預組為老齡ED 大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射；cAMP 為環(huán)磷酸腺苷；NO 為一氧化氮；ED 為勃起功能障礙；與正常組比較，aP＜0.01；與ED 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.4 各組大鼠陰莖海綿體組織PKA、eNOS、vWF 及VEGF 蛋白表達比較 與正常組比較，ED 組PKA、vWF 及VEGF 蛋白表達量顯著降低（P＜0.01）；eNOS蛋白表達降低（P＜0.05）。與ED 組比較，干預組PKA、eNOS、VEGF 蛋白表達增加（P＜0.05）；vWF 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。見圖2 和表3。

圖2 各組大鼠陰莖海綿體組織PKA、eNOS、vWF、VEGF 表達注：正常組為老齡勃起功能正常；ED 組為老齡ED 大鼠；干預組為老齡ED 大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射

表3 各組大鼠陰莖海綿體PKA、eNOS、vWF、VEGF 蛋白表達水平比較（）

表3 各組大鼠陰莖海綿體PKA、eNOS、vWF、VEGF 蛋白表達水平比較（）

注：正常組為老齡勃起功能正常大鼠；ED 組為老齡ED 大鼠；干預組為老齡ED 大鼠使用血管活性腸多肽腹腔注射；PKA 為蛋白激酶A；eNOS 為內(nèi)皮源性一氧化氮合酶；vWF 為血管性血友病因子；VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子；β-actin 為β-肌動蛋白；ED 為勃起功能障礙；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與ED 組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

4 討論

衰老所致的陰莖海綿體內(nèi)皮細胞損傷是導致ED 的主要病因之一，血管新生能力減弱伴隨者內(nèi)皮細胞的功能及數(shù)量降低，導致eNOS 表達減弱，從而導致NO 生成不足，平滑肌舒張能力減弱誘發(fā)ED[7-8]。VIP 勃起神經(jīng)遞質(zhì)通過與陰莖海綿體平滑肌細胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，活化腺苷酸環(huán)化酶后使三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為cAMP，特異性激活PKA 后陰莖充血勃起。近年來研究表明，VIP 在大鼠陰莖海綿體的表達與大鼠年齡差異無關[9]，并且能夠通過非雄激素依賴的通路參與海綿體平滑肌松弛與勃起[3]，男性ED 患者陰莖海綿體注射VIP 聯(lián)合酚妥拉明能夠顯著改善ED[10]，但是其治療機制尚未明確。

ICP 檢測結(jié)果表明，對老齡ED 大鼠腹腔注射VIP 后大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓增高，表明血管擴張后流入陰莖海綿體內(nèi)的充血量及壓力增加，側(cè)面反映出大鼠勃起功能障礙得到改善。陰莖內(nèi)皮細胞功能減退影響血管張力，vWF 主要來源于內(nèi)皮細胞，是其重要的生物標志物。本研究結(jié)果表明，VIP 干預后vWF的熒光強度及海綿竇間隙明顯增加，表明VIP 干預后陰莖海綿體內(nèi)皮細胞數(shù)量顯著增加。陰莖海綿體內(nèi)VEGF 蛋白表達隨著機體衰老而減少，而VEGF作為一種強效血管生成因子與通透因子，其與血管的生成密切相關。此外動物研究證據(jù)表明，VEGF 不僅可以促進內(nèi)皮細胞的生成，同時能夠激活eNOS 生成NO[11]，因此VEGF 調(diào)控的血管生成是改善老齡ED 的重要機制。VIP 腹腔注射能夠促進老年ED 陰莖海綿體內(nèi)VEGF 的表達，熒光結(jié)果顯示vWF 增加，提示應用VIP 后陰莖海綿體內(nèi)血管再生的同時伴隨著內(nèi)皮細胞的增生。

老年ED 大鼠海綿體內(nèi)皮細胞減少后eNOS 蛋白表達量亦明顯降低，當VIP 治療后eNOS 蛋白表達量增加，同時cAMP 與NO 的表達增加。因此，VIP可能通過VEGF 促進大鼠陰莖海綿體血管以及內(nèi)皮細胞的生成，而內(nèi)皮細胞來源的eNOS 生成的NO 增加是導致陰莖海綿體內(nèi)灌注及海綿體內(nèi)壓恢復的重要機制。VIP 能夠激活cAMP/PKA 信號通路促進VEGF 介導的內(nèi)皮細胞增殖，從而促進局灶性腦缺血的血管生成[12]。本研究中老齡ED 大鼠陰莖海綿體低表達的cAMP 與PKA 被VIP 逆轉(zhuǎn)，因此VIP 能調(diào)節(jié)大鼠陰莖海綿體cAMP/PKA 信號通路從而促進VEGF 表達以及海綿體內(nèi)血管增生，促進eNOS 表達釋放NO 進而修復勃起功能。

綜上所述，VIP 能夠有效改善老齡大鼠的勃起功能，其作用機制可能通過調(diào)控cAMP/PKA 通路以及改善陰莖海綿體內(nèi)皮功能有關。