王樹(shù)奇 吉利利 解鴻蕾

作為一種對(duì)視網(wǎng)膜、心肌、腸、胃、肺和肝臟起到保護(hù)作用的特殊氨基酸，?；撬嵩谔岣呷梭w免疫力等方面具有重要作用，在嬰幼兒神經(jīng)中樞和大腦發(fā)育方面也能起到一定的促進(jìn)作用。目前針對(duì)嬰幼兒配方食品（乳粉）中?；撬岬臋z測(cè)主要采用的是儀器分析法。其中，氨基酸分析儀測(cè)定法具有選擇性好、靈敏度高和穩(wěn)定強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但測(cè)定使用的儀器售價(jià)較高且分析時(shí)間較長(zhǎng)；薄層色譜法和酸堿滴定法具有實(shí)驗(yàn)成本較為低廉等優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度較低，很難實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)測(cè)量。本文在國(guó)標(biāo)方法（GB 5009.169-2016）第二法的基礎(chǔ)上，對(duì)前處理過(guò)程進(jìn)行了討論，得到了優(yōu)化后可用于日常檢測(cè)工作的方法。

一、材料與設(shè)備

1.標(biāo)準(zhǔn)品和試劑。牛磺酸（色譜純），天津科密歐；鹽酸甲胺（色譜純），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；丹磺酰氯（色譜純），上海安譜；乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher；亞鐵氰化鉀（分析純），天津科密歐；乙酸鋅（分析純），天津科密歐。

2.儀器與設(shè)備。LC-20A液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；C18色譜柱（5?m，4.6×250mm），納譜分析技術(shù)有限公司；VORTEX 3渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；SQP電子天平，德國(guó)Sartorius公司。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑的配制。（1）?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（0.5mg·mL-1）的配制。稱量約25mg?；撬針?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50mL燒杯中，加入約20mL水溶解后轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶中，用水定容。

（2）試劑的配制。①丹磺酰氯溶液：稱取0.150g丹磺酰氯于100mL容量瓶中，用乙腈定容；②鹽酸甲胺溶液：稱取0.5g鹽酸甲胺于25mL容量瓶中，用水溶解定容；③乙酸鈉緩沖液：稱取8.44g乙酸鈉于1000mL容量瓶中，用水溶解定容，經(jīng)0.45?m微孔濾膜過(guò)濾；④乙酸鋅溶液：稱取15.0g乙酸鋅于50mL容量瓶中，用水定容；⑤亞鐵氰化鉀溶液：稱取7.5g亞鐵氰化鉀于50mL容量瓶中，用水定容。

2.樣品的提取。稱取經(jīng)均勻具有代表性的樣品2.5g于50mL塑料離心管中，加入40mL（45℃）水將樣品溶解后，再加入蛋白沉降劑（亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液）各0.5mL定容至25mL刻度線，在振蕩器上振蕩5min后，經(jīng)離心（5000r/min離心5min）后取上清溶液過(guò)濾待用。

3.衍生。取1mL濾液于50mL塑料離心管中，加入碳酸鈉緩沖溶液和丹磺酰氯溶液各1mL，渦旋2min后放入37℃氣浴恒溫培養(yǎng)箱，120min后快速加入0.1mL鹽酸甲胺溶液于離心管中終止反應(yīng)。

4.?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液的制備。吸取適當(dāng)?shù)呐；撬針?biāo)準(zhǔn)中間液，相當(dāng)于0?g·mL-1、0.5?g·mL-1、2.0?g·mL-1、5.0?g·mL-1、10.0?g·mL-1、20.0?g·mL-1和50.0?g·mL-1的?；撬嵘蠙C(jī)工作液，其他操作步驟同實(shí)驗(yàn)方法中的衍生步驟。

5.儀器條件。液相色譜儀：島津LC-20A；進(jìn)樣量：20?L；色譜柱信息：C18色譜柱（5?m，4.6×250mm），納譜分析技術(shù)有限公司；柱流量：1.0mL·min-1；柱溫：35℃；洗脫程序：等度洗脫（乙酸鈉溶液：乙腈=7：3，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4.4）；檢測(cè)波長(zhǎng)（熒光檢測(cè)器）：Ex-330nm，Em-530nm。

三、結(jié)果與分析

1.樣品前處理方式的優(yōu)化。加入沉淀劑亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液定容至50mL，其他操作步驟同實(shí)驗(yàn)方法。由表1可知，在沉淀劑為0.5mL時(shí)，樣品衍生溶液呈現(xiàn)澄清狀態(tài)且峰面積響應(yīng)值較高，故加入各0.5mL的亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液。

設(shè)定不同的提取溶液和乙酰氯溶液比例，其他操作步驟同實(shí)驗(yàn)方法。由表2可知，提取溶液和乙酰氯溶液的比例為1：1時(shí)，樣品衍生溶液呈現(xiàn)澄清狀態(tài)且單位峰面積響應(yīng)值較高，故最終選取提取溶液和乙酰氯的比例為1：1。

設(shè)定不同的碳酸鈉溶液使用量，其他操作步驟同實(shí)驗(yàn)方法。由表3可知，當(dāng)加入1.00mL碳酸鈉溶液時(shí)，樣品衍生溶液的狀態(tài)為無(wú)絮狀物沉淀且峰面積響應(yīng)值達(dá)到飽和，故最終選取1.0mL的碳酸鈉試劑使用量。

設(shè)定不同的衍生時(shí)間，其他操作步驟同實(shí)驗(yàn)方法。由表4可知，當(dāng)衍生時(shí)間為60min，樣品響應(yīng)值達(dá)到飽和，但是該樣品有顏色，長(zhǎng)時(shí)間的話容易對(duì)色譜柱產(chǎn)生影響，故選擇衍生時(shí)間為120min。

在不同的衍生溫度下衍生120min，其他操作步驟同實(shí)驗(yàn)方法。由表5可知，在25℃條件下衍生120min，樣品響應(yīng)值達(dá)到飽和，但是該樣品有顏色，本著保護(hù)色譜柱的原則，最終選擇在37℃條件下衍生120min。

2.方法學(xué)驗(yàn)證。（1）檢出限、定量限與線性方程。經(jīng)過(guò)對(duì)牛磺酸對(duì)照品色譜圖的研究與分析，最終以牛磺酸對(duì)照品檢測(cè)的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以?；撬釋?duì)照品檢測(cè)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得到線性回歸方程：y=467556x+134103，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.9997，線性范圍為0-50?g·mL-1。通過(guò)對(duì)?；撬岬馁|(zhì)量濃度經(jīng)3倍和10倍的信噪比計(jì)算，得到優(yōu)化方法的檢出限為0.05mg/100g，定量限為0.1mg/100g。

（2）優(yōu)化方法與國(guó)標(biāo)方法的精密度比對(duì)。選取某品牌的奶粉，通過(guò)優(yōu)化后的方法和國(guó)標(biāo)方法的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在重復(fù)6次的前提下，優(yōu)化后的方法和國(guó)標(biāo)方法的檢測(cè)平均值分別為40.7mg/100g和40.5mg/100g。國(guó)標(biāo)方法的RSDs為3.17%，本方法的RSDs為3.55%，兩個(gè)方法的RSDs為0.38%，說(shuō)明優(yōu)化后的方法和國(guó)標(biāo)方法的檢測(cè)數(shù)值沒(méi)有明顯區(qū)別。具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表6。

（3）實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。對(duì)某品牌的奶粉進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在20倍檢出限（1.0mg/100g）、5倍定量限（5mg/100g）和10倍定量限（10mg/100g）三個(gè)水平，每個(gè)水平進(jìn)行6次加標(biāo)回收驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，三個(gè)水平的加標(biāo)回收率依次為101.7%、95.3%和95.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.39%-7.75%。

綜上所述，本方法對(duì)國(guó)標(biāo)方法（GB 5009.169-2016第二法）的樣品預(yù)處理過(guò)程進(jìn)行了深入研究和探討，該方法的回收率為95.1%-101.7%，RSDs（n=6）為3.55%，方法檢出限為0.05mg/100g，定量限為0.1mg/100g。通過(guò)對(duì)前處理過(guò)程的優(yōu)化，降低了無(wú)機(jī)試劑和耗材的使用，具有較高的檢測(cè)效率、較低的檢測(cè)成本和較好的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足日常檢測(cè)需求。

作者簡(jiǎn)介：王樹(shù)奇（1985-），男，黑龍江哈爾濱人，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称罚ㄈ槠罚┌踩c檢測(cè)方法。

吉利利（1987-），女，天津人，項(xiàng)目經(jīng)理，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称罚ㄈ槠罚I(yíng)養(yǎng)與安全。

解鴻蕾（1989-），女，黑龍江哈爾濱人，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ獭?/p>