褚佳琪 陳 剛 王祎琳 王磊麗 宋 婕 韓虹宇 陳雨婷 周 光

流行性感冒是由流感病毒引發(fā)的急性傳染性疾病,潛伏期短、傳染性強(qiáng),其病原體可分為甲、乙、丙3型,其中甲型病毒最為常見(jiàn)且危害性最強(qiáng),易引發(fā)大面積暴發(fā),誘發(fā)病毒性肺炎、急性肺損傷,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致多器官衰竭,危及患者生命[1]。甲型病毒具有高隨機(jī)遺傳漂變的特性,疫苗注射無(wú)法有效預(yù)防,臨床僅能使用M2離子通道及神經(jīng)氨酸酶抑制劑用以抑制子代病毒復(fù)制,但耐藥性強(qiáng)、不良反應(yīng)較多[2]。連翹苷是中藥連翹的主要活性成分,具有抗氧化、抗菌、抗癌及抗病毒等生物學(xué)活性。研究表明,連翹苷可改善由甲型流感病毒引發(fā)的小鼠急性肺損傷,表現(xiàn)出良好的抗病毒活性[3]。然而目前關(guān)于其對(duì)甲型流感病毒感染后免疫功能及炎性細(xì)胞因子水平的影響研究鮮有。本研究建立小鼠H1N1病毒感染模型,觀察連翹苷對(duì)其免疫功能指標(biāo)和炎性細(xì)胞因子的影響。

材料與方法

1.材料：BALB/c小鼠80只,SPF級(jí),雄性,6～8周齡,體質(zhì)量為20±2g,購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司,生產(chǎn)許可證為SCXK(滬)2017-0012,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)為2021-0009。H1N1鼠肺適應(yīng)株FM1,購(gòu)自上海巴斯德研究所,生物安全實(shí)驗(yàn)室雞胚傳代,-80℃保存。測(cè)定其半數(shù)致死量為10-2.58/0.05ml。

2.藥物、主要試劑、儀器：連翹苷(純度：98%,上海源葉生物科技有限公司),Toll樣受體7(toll-like receptors 7,TLR7)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)信號(hào)通路激活劑羅唑利賓(Loxoribine)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒(上海百舜生物科技有限公司),腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司),兔抗小鼠CD4、CD8、TLR7、MyD88一抗[艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司]。GENios Pro酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司),FACSCanto流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司),CX23光學(xué)顯微鏡(日本Olympus株式會(huì)社)。

3.建模與分組：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后,吸入乙醚麻醉,選取60只以2倍濃度半數(shù)致死量病毒滴液50μl滴鼻,隨機(jī)數(shù)字法分為感染組、連翹苷組、連翹苷+Loxoribine組,各20只;另取20只健康小鼠滴鼻等體積0.9%氯化鈉溶液,設(shè)為正常組[4]。

4.干預(yù)方式：滴鼻4h后,連翹苷+Loxoribine組大鼠灌胃連翹苷(200mg/kg溶于0.9%氯化鈉溶液),1h后腹腔注射Loxoribine(1毫克/只溶于PBS溶液);連翹苷組大鼠灌胃連翹苷(200mg/kg溶于0.9%氯化鈉溶液),1h后腹腔注射等量PBS;正常組、感染組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液,1h腹腔注射等量PBS。每日1次,干預(yù)14天[5,6]。

5.組織取材：前期預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示小鼠第8天開(kāi)始出現(xiàn)死亡,故干預(yù)第7天每組隨機(jī)選取10只小鼠,稱取體質(zhì)量,稱重后腹腔戊巴比妥鈉深度麻醉,抽取腹主動(dòng)脈血,抗凝后4℃冷藏;采血后脊椎脫臼處死大鼠,冰上開(kāi)胸取其全肺,稱取濕重,計(jì)算肺指數(shù)(%)=肺濕重/體質(zhì)量×100%;切取同位置肺組織,投入4%多聚甲醛中固定24h,脫水、包埋、浸蠟,切為4μm切片用于病理學(xué)觀察;剩余肺組織分成3份,投入液氮中冷凍保存,分別用于炎性細(xì)胞因子、病毒載量及蛋白檢測(cè)。末次干預(yù)結(jié)束后,統(tǒng)計(jì)各組剩余大鼠存活天數(shù)(末次干預(yù)后未死亡記錄為14天)及死亡數(shù),計(jì)算死亡率。

6.肺組織炎性細(xì)胞因子檢測(cè)：取冷凍保存的肺組織,研磨、勻漿,低溫8500r/min離心10min(離心半徑8cm)取上清,ELISA法檢測(cè)肺組織中TNF-α、IL-6含量,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)操作步驟,波長(zhǎng)570nm經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值,坐標(biāo)紙畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線得出濃度。

7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞占比：取腹主動(dòng)脈采集外周血,加入兔抗小鼠CD4、CD8一抗,避光20min,低溫離心3500r/min離心10min(離心半徑8cm),吸棄上清,經(jīng)PBS洗滌、多聚甲醛定容、細(xì)胞濾網(wǎng)(300目)過(guò)濾,經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞構(gòu)成比,計(jì)算CD4+/CD8+。

8.qRT-PCR檢測(cè)肺組織病毒相對(duì)表達(dá)量：取冷凍保存的肺組織,低溫研缽充分研磨,加入PBS勻漿,經(jīng)Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系：Sybr Green染料10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,Mix 1μl,dd H2O補(bǔ)充至20μl;反應(yīng)條件：50℃ 2min,95℃ 8min,95℃ 20s,62℃ 30s,72℃ 1min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),得出最終CT值,以GAPDH為內(nèi)參基因,2-△△CT法分析計(jì)算病毒基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用引物：FM1：上游引物：5′-GAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3′;下游引物：5′-GCACAGAGACTTGAAGATGT-3′;GAPDH：上游引物：5′-TGAAATGTGCACGCACCAAG-3′;下游引物：5′-GGGAAGCAGCATTCAGGTCT-3′。重復(fù)3次取均值。

9.HE染色觀察肺組織病理變化：取肺組織切片,常規(guī)HE染色,顯微鏡下觀察肺組織病理變改變,并拍照記錄。

10.Western blot法檢測(cè)肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)量：取冷凍保存的肺組織,研磨、勻漿,加入RIPA裂解液,低溫離心10000r/min離心10min(離心半徑15cm)取上清并定量。取少量樣本蛋白,混合4倍量上樣緩沖液,水浴加熱,電泳分離,濕轉(zhuǎn)至膜,5%脫脂牛奶封閉1h,加入稀釋(1∶500)兔抗小鼠TLR7、MyD88一抗,冰箱冷藏過(guò)夜,TBST液清洗,加入稀釋(1∶2000)二抗,常溫下孵育2h,TBST液清洗,化學(xué)發(fā)光液發(fā)光、暗盒顯影,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,成像分析儀掃描并分析TLR7、MyD88相對(duì)蛋白表達(dá)量。

結(jié) 果

1.存活天數(shù)及死亡率：與感染組比較,連翹苷組存活天數(shù)增加,死亡率降低(P<0.05);與連翹苷組比較,連翹苷+Loxoribine組存活天數(shù)減少,死亡率升高(P<0.05),詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠存活天數(shù)及死亡率比較

2.肺指數(shù)：與正常組比較,感染組肺指數(shù)升高(P<0.05);與感染組比較,連翹苷組肺指數(shù)降低(P<0.05);與連翹苷組比較,連翹苷+Loxoribine組肺指數(shù)升高(P<0.05),詳見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肺指數(shù)比較

3.肺組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6：與正常組比較,感染組肺組織TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);與感染組比較,連翹苷組肺組織TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05);與連翹苷組比較,連翹苷+Loxoribine組肺組織TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05),詳見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平比較

4.外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞占比：與正常組比較,感染組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞占比、CD4+/CD8+降低,CD8+T淋巴細(xì)胞占比升高(P<0.05);與感染組比較,連翹苷組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞占比、CD4+/CD8+升高,CD8+T淋巴細(xì)胞占比降低(P<0.05);與連翹苷組比較,連翹苷+Loxoribine組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞占比、CD4+/CD8+降低,CD8+T淋巴細(xì)胞占比升高(P<0.05),詳見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞占比比較

5.肺組織病毒表達(dá)量：與感染組比較,連翹苷組肺組織病毒相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與連翹苷組比較,連翹苷+Loxoribine組肺組織病毒相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05),詳見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠肺組織病毒相對(duì)表達(dá)量比較

6.肺組織病理變化：HE染色結(jié)果顯示,正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡狀態(tài)正常;感染組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,肺泡壁斷裂變形,組織間隙腫脹,毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);連翹苷組、連翹苷+Loxoribine組小鼠肺泡壁恢復(fù)連接,組織機(jī)構(gòu)成形,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,間隙腫脹程度變小,連翹苷組病理改善更為顯著,詳見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織病理變化(HE染色,×200)A.正常組;B.感染組;C.連翹苷組;D.連翹苷+Loxoribine組

7.肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)量：與正常組比較,感染組肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)量升高(P<0.05);與感染組比較,連翹苷組肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)量降低(P<0.05);與連翹苷組比較,連翹苷+Loxoribine組肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)量升高(P<0.05),詳見(jiàn)表6、圖2。

圖2 肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)A.正常組;B.感染組;C.連翹苷組;D.連翹苷+Loxoribine組

表6 各組小鼠肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)量比較

討 論

甲型流感是一種高暴發(fā)性呼吸道急癥,主要通過(guò)飛沫傳播,近年來(lái)全球年均發(fā)病人數(shù)超百萬(wàn),已成為人際傳播主要毒株之一[7,8]。病毒可侵肺誘發(fā)支氣管及細(xì)支氣管周?chē)g質(zhì)充血,導(dǎo)致肺泡腔內(nèi)滲出炎性液體,形成透明膜附著于肺泡表面,球形病毒包涵體大量出現(xiàn),并擴(kuò)散至肺部[9,10]。病毒大量復(fù)制導(dǎo)致固有免疫受損,免疫T細(xì)胞不能有效應(yīng)答,機(jī)體抗病毒能力降低,特異性免疫被激活,在其作用下合成并釋放大量促炎性細(xì)胞因子,誘發(fā)免疫炎性損傷,加劇肺組織水腫及肺泡出血[11,12]。因此,修復(fù)固有免疫,抑制炎性反應(yīng)是治療甲型流感的關(guān)鍵。

中醫(yī)治療病毒性疾病由來(lái)已久,具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)及低不良反應(yīng)等多種優(yōu)勢(shì)[13]。連翹是中醫(yī)防瘟要藥,取自木犀科植物連翹干燥果實(shí),可治清熱散結(jié)、消腫解毒,連翹苷是自連翹中提取的木脂素類(lèi)單體,具有良好的抗病毒活性,是常用中成藥連花清瘟膠囊、雙黃連的主要有效成分之一[14,15]。本研究結(jié)果顯示,與感染組比較,連翹苷組存活天數(shù)增加,死亡率、肺指數(shù)、肺組織TNF-α和IL-6水平、外周血CD8+T淋巴細(xì)胞占比、肺組織病毒相對(duì)表達(dá)量降低,外周血CD4+T淋巴細(xì)胞占比、CD4+/CD8+升高,提示連翹苷可抑制病毒復(fù)制,改善肺功能及免疫功能,降低炎性細(xì)胞因子水平,從而治療H1N1感染。

TLR是機(jī)體重要的固有免疫識(shí)別受體,TLR7是其常見(jiàn)亞型,廣泛分布于多種免疫細(xì)胞內(nèi),可識(shí)別流感病毒RNA,激活下游轉(zhuǎn)接蛋白分子MyD88,誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子NF-κB活化并轉(zhuǎn)移至胞核,促進(jìn)炎性細(xì)胞因子大量合成及釋放,形成級(jí)聯(lián)反應(yīng),加劇免疫炎性損傷[16～18]。Wang等[19]研究認(rèn)為,抑制TLR7/MyD88信號(hào)通路可顯著抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá),減輕甲型流感病毒感染,提示TLR7有望成為甲型流感治療新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,感染組肺組織TLR7、MyD88蛋白表達(dá)量升高,經(jīng)連翹苷干預(yù)后均降低,提示H1N1病毒感染后TLR7/MyD88通路異常激活,而連翹苷可能通過(guò)抑制TLR7/MyD88信號(hào)通路活性來(lái)發(fā)揮抗病毒療效。

綜上所述,連翹苷可抑制H1N1病毒復(fù)制,改善肺功能及免疫功能,可能通過(guò)抑制TLR7/MyD88信號(hào)通路活性降低炎性細(xì)胞因子水平,從而保護(hù)H1N1感染小鼠。今后將增加轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)實(shí)驗(yàn)作為研究方向,進(jìn)一步探究連翹苷抗H1N1病毒感染株的可能機(jī)制。