李 強(qiáng) 靳書濱 霍韶軍

腎缺血再灌注(renal ischemia-reperfusion,RIR)損傷常繼發(fā)于腎臟外科手術(shù)及術(shù)后恢復(fù)過程,是引發(fā)急性腎衰竭的高危因素[1]。RIR損傷病理機(jī)制復(fù)雜,炎性反應(yīng)在其進(jìn)展過程中具有重要作用[2,3]。Toll樣受體4/核因子-κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB,TLR4/NF-κB)是機(jī)體炎性反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路,有研究發(fā)現(xiàn),TLR4/NF-κB信號(hào)通路在大腦、心肌、小腸缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用[4～6]。本研究旨在探討TLR4/NF-κB信號(hào)通路在RIR損傷中的作用及其機(jī)制,以期為RIR損傷防治探索新的作用靶點(diǎn)。

材料與方法

1.材料：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠96只(7周齡,220±20g),購自河北伊維沃生物科技有限公司[SCXK(冀)2020-002],清潔環(huán)境飼養(yǎng)：室溫25℃、相對(duì)濕度55%～65%,光照黑暗各12h交替。(2)藥物與試劑：TAK242(TLR4抑制劑)購自美國MCE公司;LPS(Nrf2激活劑)購自美國Invivogen公司;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司;總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司;熒光定量PCR試劑盒購自上海Novoprotein公司;腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、TLR4、NF-κB p65抗體購自北京博奧森生物科技有限公司;IgG二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;ECL化學(xué)發(fā)光液購自上海天能科技有限公司。

2.動(dòng)物分組、造模與給藥：按隨機(jī)數(shù)字表法將96只大鼠分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、Model+TAK242組和Model+LPS組,每組24只。除Sham組外,其他組均參照易小敏等[7]報(bào)道的方法,夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45min復(fù)制RIR大鼠模型;Sham組行相同的手術(shù)通路,但不夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈。給藥：造模前7天開始,Model+TAK242組以TAK242 10mg/kg劑量腹腔注射給藥,ASI+LPS組以LPS 5mg/kg劑量腹腔注射給藥,Sham組和Model組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液,各組注射體積均為6ml/kg[8,9]。

3.血清腎功能指標(biāo)檢測：再灌注6h后,各組分別隨機(jī)取12只大鼠,麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,3500r/min離心5min分離血清,通過全自動(dòng)分析儀檢測BUN、SCr水平。

4.HE染色法觀察腎組織病理學(xué)改變及病理評(píng)分：取血完成后,頸椎脫臼處死大鼠,取左側(cè)腎組織置于10%中性甲醛溶液中固定72h,經(jīng)石蠟包埋、5μm厚度切片、二甲苯透明、梯度乙醇脫水處理后,行常規(guī)HE染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理學(xué)改變。400倍光學(xué)顯微鏡下,每張切片隨機(jī)選取互不重疊的10個(gè)視野,根據(jù)Li等[10]報(bào)道的方法行病理評(píng)分：視野內(nèi)未見病變記0分,病變面積占視野≤10%記1分、10%～25%(含)記2分、25%～50%(含)記3分、50%～75%記4分、>75%記5分。

5.透射電子顯微鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：取部分右腎組織,修飾成1mm3小塊后置于2.5%戊二醛溶液中固定48h,1%鋨酸溶液中固定2h,環(huán)氧樹脂包埋,50nm厚度超薄切片,醋酸鈾染色30min、檸檬酸鉛復(fù)染30min,通過透射電子顯微鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

6.腎組織TLR4、NF-κB p65mRNA表達(dá)檢測：取各組剩余的12只大鼠,麻醉后在冰上取右側(cè)腎臟組織100mg,冰上研磨勻漿,分離純化總RNA、檢測RNA濃度和純度、將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)條件為95℃ 5min、95℃ 30s,62℃、30s,72℃、30s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),然后72℃延伸10min,4℃ 5min終止反應(yīng),通過凝膠分析儀成像。目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算(β-actin為內(nèi)參)。RT-PCR引物序列詳見表1。

表1 RT-PCR引物序列

7.腎組織TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測：取右側(cè)腎臟組織100mg,加入6倍量4℃裂解液研磨勻漿,4℃、12000r/min離心25min后取上清液,檢測蛋白濃度后,SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,濕法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1h后,TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κB p65、β-actin抗體4℃孵育過夜,IgG二抗37℃孵育1.5h,滴加ELC顯色,以β-actin為內(nèi)參半定量目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.各組大鼠血清BUN、SCr水平的比較：與Sham組比較,Model組血清BUN、SCr水平升高(P<0.05);與Model組比較,Model+TAK242組BUN、SCr水平降低(P<0.05),Model+LPS組BUN、SCr水平升高(P<0.05,圖1)。

圖1 各組大鼠血清BUN、SCr水平的比較(n=12)與Sham組比較,*P<0.05;與Model組比較,#P<0.05

2.各組大鼠腎組織病理學(xué)改變及病理評(píng)分的比較：Sham組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)未見異常;Model組可見腎小球體積增大、系膜增生,腎小管管腔擴(kuò)張、管型形成,細(xì)胞空泡變性,腎小球及間質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤;與Model組比較,Model+TAK242組腎小球、腎小管病理學(xué)改變及腎小球、間質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤均明顯改善,Model+LPS組腎小球體積增大、系膜增生、腎小管管腔擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變明顯加重。與Sham組比較,Model組病理評(píng)分升高(P<0.05);與Model組比較,Model+TAK242組病理評(píng)分降低(P<0.05),Model+LPS組病理評(píng)分升高(P<0.05,圖2、圖3)。

圖2 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變(HE染色,×400)A.Sham組;B.Model組;C.Model+TAK242組;D.Model+LPS組

圖3 各組大鼠腎組織病理評(píng)分的比較(n=12)與Sham組比較,*P<0.05;與Model組比較,#P<0.05

3.各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的比較：Sham組大鼠腎小管微絨毛清晰完整,上皮細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)未見異常。Model組可見腎小管微絨毛壞死脫落,上皮細(xì)胞部分壞死,可見線粒體腫脹、膜破裂、嵴斷裂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,核糖體減少。與Model組比較,Model+TAK242組腎小管上皮細(xì)胞上述超微結(jié)構(gòu)改變明顯減輕,Model+LPS組上述超微結(jié)構(gòu)病變明顯加重(圖4)。

圖4 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變(醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,×10000)A.Sham組;B.Model組;C.Model+TAK242組;D.Model+LPS組

4.各組大鼠腎組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)的比較：與Sham組比較,Model組TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量升高(P<0.05);與Model組比較,Model+TAK242組TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量降低(P<0.05),Model+LPS組TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量升高(P<0.05,圖5)。

圖5 各組大鼠腎組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)的比較(n=12)與Sham組比較,*P<0.05;與Model組比較,#P<0.05

5.各組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表達(dá)的比較：與Sham組比較,Model組TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表達(dá)量均升高(P<0.05);與Model組比較,Model+TAK242組TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05),Model+LPS組TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表達(dá)量均升高(P<0.05,圖6、圖7)。

圖6 各組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65mRNA表達(dá)的比較(n=12)與Sham組比較,*P<0.05;與Model組比較,#P<0.05

圖7 各組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)的比較(n=12)與Sham組比較,*P<0.05;與Model組比較,#P<0.05

討 論

腎臟血流灌注豐富,對(duì)缺血及再灌注過程非常敏感,RIR損傷是影響腎臟手術(shù)患者預(yù)后的重要因素,因此,防治RIR損傷一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45min制備RIR大鼠模型具有操作簡單、重復(fù)性好、與人類臨床RIR病理特點(diǎn)近似的優(yōu)點(diǎn),是普遍認(rèn)可的一種RIR動(dòng)物模型制備方法。本研究發(fā)現(xiàn),RIR模型大鼠血清BUN、SCr水平明顯升高,腎組織呈現(xiàn)腎小球體積增大、系膜增生,腎小管管腔擴(kuò)張、管型形成,細(xì)胞空泡變性,腎小球及間質(zhì)區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變,病理評(píng)分明顯升高,與牟俊杰等[11]研究報(bào)道一致。腎小管上皮細(xì)胞可見部分壞死以及線粒體腫脹、膜破裂、嵴斷裂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,核糖體減少等超微結(jié)構(gòu)病變,與周海濤等[12]和陳明霞等[13]研究報(bào)道一致。

炎性反應(yīng)是組織缺血再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素,有研究發(fā)現(xiàn)RIR誘發(fā)中性粒細(xì)胞聚集并釋放炎性細(xì)胞因子、黏附分子等,誘發(fā)炎性反應(yīng)并促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤[14]。炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β除了能夠誘發(fā)炎性反應(yīng)外,還能趨化中性粒細(xì)胞等進(jìn)一步釋放炎性細(xì)胞因子而加重炎性反應(yīng)[15]。TLR是一種跨膜識(shí)別受體,其中TLR4能夠特異性識(shí)別革蘭陰性菌胞壁上的脂多糖,介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子釋放而激發(fā)炎性反應(yīng)[16]。NF-κB為TLR4下游靶基因,是由p50/p65二聚體形成的一種核轉(zhuǎn)錄因子,核轉(zhuǎn)位后p65亞基能夠與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá),進(jìn)而加重炎性反應(yīng)[17]。劉紫陽等[18]研究發(fā)現(xiàn),TAK242通過抑制TLR4蛋白表達(dá)而減輕炎性反應(yīng),對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷起到保護(hù)作用。鐘祥等[19]研究發(fā)現(xiàn),TAK242能夠抑制TLR4及炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6)表達(dá),減輕心臟死亡大鼠肝臟缺血再灌注損傷。

本研究發(fā)現(xiàn),RIR模型大鼠腎組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量明顯升高,TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯提高;TLR4抑制劑TAK242能夠明顯降低RIR大鼠腎組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量,降低TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量;TLR4激活劑LPS則明顯提高RIR大鼠腎組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量,提高TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量。

綜上所述,TLR4/NF-κB信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)參與RIR損傷過程,可作為防治RIR損傷的新靶點(diǎn)。接下來筆者課題組將探索以TLR4/NF-κB通路為作用靶點(diǎn)、能夠防治RIR損傷的新型藥物。