龍春蘭,周 宇,易 勤,譚 彬,許 皓,魏光輝,朱 靜△

1.國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,重慶400014; 2.揚(yáng)州大學(xué)附屬淮安市婦幼保健院兒童康復(fù)科,江蘇淮安 223001;3.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400014;4.兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400014;5.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶400014;6.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科,重慶 400014

Prdm14在早期多能性細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞(PGCs)以及胚胎干細(xì)胞(ESCs)中表達(dá),具有維持細(xì)胞干性和抑制細(xì)胞分化的效應(yīng)[4-5]。ESCs中,多能性主要由轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog等構(gòu)成的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來維持[6]。全基因組定位分析顯示,Prdm14與Oct4、Nanog、Sox2等其他關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子廣泛共定位,表明Prdm14已整合到核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中[7-8]。在PGCs 發(fā)育過程中,重獲多向分化潛能是PGCs命運(yùn)決定的重要調(diào)控事件之一,而Prdm14是PGCs 能否重新獲得多向分化潛能的關(guān)鍵調(diào)控因子。在PGCs 中,Prdm14與Tfap2c和Blimp1協(xié)同作用,上調(diào)生殖細(xì)胞和多能性基因,同時(shí)抑制WNT信號(hào)和體細(xì)胞標(biāo)記物[9]。Prdm14的表達(dá)隨著 PGCs 分化而受到抑制,在一定條件下,來源于Prdm14+/+胚胎的PGCs 能夠去分化形成多能性的胚胎生殖細(xì)胞,而Prdm14-/-胚胎的原始生殖樣細(xì)胞(PGCLCs)幾乎不能形成胚胎生殖細(xì)胞樣克隆,并且Prdm14-/-的PGCLCs中,其核心多能性基因及生殖細(xì)胞相關(guān)基因未能重新激活[10]。

Prdm14也有助于在缺乏多向分化潛能的細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。研究顯示,當(dāng) Prdm14 與 Oct4、Sox2、Klf4 共同表達(dá)時(shí)能夠提高成纖維細(xì)胞的重編程效率[7]。與植入后的外胚層和ESCs相比,外胚層干細(xì)胞(EpiSC)不表達(dá)Prdm14,并且不具備向PGCs特化的潛能,外源性Prdm14能與Klf2協(xié)同作用,加速和促進(jìn)小鼠EpiSCs向幼稚多能狀態(tài)的ESCs逆轉(zhuǎn)及向PGC特化[11-12]。

Prdm14可通過干性因子等構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)ESCs、生殖細(xì)胞的多能性,然而,Prdm14在其他細(xì)胞中的表達(dá)及作用如何,尚不清楚。因此,本研究擬探討Prdm14對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞增殖及干性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 C3H10T1/2細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.2儀器與試劑 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo公司),熒光定量PCR儀(美國(guó) Bio-Rad公司),凝膠成像儀(美國(guó) Bio-Rad公司),倒置熒光顯微成像系統(tǒng)(日本 Nikon公司),柱式RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司],過表達(dá)Prdm14慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司),胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司),RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),兔抗Prdm14 抗體(Abcam公司,批號(hào):187881),兔抗Sox2抗體(ProteinTec公司,批號(hào):11064-1-AP),兔抗Oct4抗體(ProteinTec公司,批號(hào):11263-1-AP),兔抗Nanog抗體(Zenbio公司,批號(hào):385080),小鼠抗β-actin、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、Cy3山羊抗兔二抗、Cy3山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、Hoechst 33342(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期C3H10T1/2細(xì)胞,消化傳代后,補(bǔ)充新鮮完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)至10 mL,晃動(dòng)培養(yǎng)皿,使細(xì)胞均勻分布,于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2構(gòu)建Prdm14過表達(dá)細(xì)胞株 本研究選用Tet-on可誘導(dǎo)基因表達(dá)慢病毒系統(tǒng),可在目的細(xì)胞中獲得可靈敏調(diào)控的目的基因表達(dá)。在細(xì)胞培養(yǎng)基中不含多西環(huán)素(Dox)時(shí),目的基因本底表達(dá)量極低,加入Dox后,目的基因誘導(dǎo)表達(dá)量極高。載體信息如下: 基因名稱為Prdm14(NM_001081209),載體名稱為CV259,元件順序?yàn)?TetIIP-MCS-3FLAG-CMV-EGFP-Ubi-TetR-IRES-Puromyc。本實(shí)驗(yàn)分為空白組(正常C3H10T1/2)、陰性對(duì)照組(感染慢病毒空載體的C3H10T1/2)以及實(shí)驗(yàn)組(感染Prdm14慢病毒的C3H10T1/2)。

基于對(duì)青少年自我價(jià)值感及道德判斷能力與價(jià)值觀關(guān)系的研究，在自我價(jià)值感中，自我觀與人際情感之間具有正向關(guān)系，其他則為負(fù)向。換言之，自我觀越重的學(xué)生，其自我價(jià)值感越強(qiáng)，并以此更加關(guān)注自身的成長(zhǎng)，形成良性循環(huán)。與此同時(shí)，群體觀與自我價(jià)值感卻存在著互相關(guān)聯(lián)，自我觀強(qiáng)導(dǎo)致群體觀低、人際價(jià)值感高。

按2×104個(gè)細(xì)胞/孔于無(wú)菌6孔板中均勻接種細(xì)胞,培養(yǎng)12 h后,加入適量病毒,感染24 h后更換為完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況,以確定慢病毒是否感染成功。嘌呤霉素篩選后,經(jīng)Dox誘導(dǎo)48 h,收集細(xì)胞用作后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)Prdm14 mRNA表達(dá) 參考RNA柱式提取試劑盒說明書,提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,隨后將經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-qPCR,以β-actin為內(nèi)參,以2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,檢測(cè)3組細(xì)胞中Prdm14 mRNA表達(dá)情況,引物見表1。

表1 引物序列

1.3.4蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測(cè) 收集細(xì)胞沉淀,加入400 μL裂解液[含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)],直接混勻,冰上裂解10 min離心,取上清液,即為總蛋白;變性后的蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入稀釋好的一抗(Prdm14、Sox2、Oct4、Nanog),4 ℃過夜。次日,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜經(jīng)復(fù)溫、TBST緩沖液漂洗后,加入相應(yīng)的二抗,室溫孵育1 h,隨后采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑,于化學(xué)發(fā)光顯影成像系統(tǒng)成像,采集圖片,通過Image J對(duì)圖像灰度值進(jìn)行分析。

1.3.5堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè) ALP主要存在于物質(zhì)交換活躍處。ESCs、PGCs 前體細(xì)胞等干性細(xì)胞均呈ALP陽(yáng)性,為進(jìn)一步探索高表達(dá) Prdm14對(duì) C3H10T1/2細(xì)胞的作用,本研究進(jìn)行了ALP 活性檢測(cè)。分別收集陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,取100 μL細(xì)胞懸液滴于防脫載玻片,室溫充分干燥后,4%多聚甲醛固定,滴加配制好的ALP孵育液,進(jìn)行ALP染色,鏡檢,ALP活性部位為藍(lán)色;根據(jù)ALP活性檢測(cè)試劑盒說明書,檢測(cè)在不同組別培養(yǎng)上清液中的ALP活性,以DEA酶活力單位表示。

1.3.6細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 96孔板中按3 000個(gè)細(xì)胞/孔加入細(xì)胞懸液,每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔,輕晃培養(yǎng)板,使細(xì)胞均勻分布,于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)Dox誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn):0、24、48、72、96 h,每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并及時(shí)更換新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,在不同時(shí)間點(diǎn)吸棄板中的舊培養(yǎng)基,每孔重新加入含10 μL CCK-8的完全培養(yǎng)基100 μL,于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度(A)。

1.3.7細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞,以每孔400、800、1 600個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種于6 cm培養(yǎng)皿中,混勻,置37 ℃、5% CO2條件下,靜置培養(yǎng)14 d,培養(yǎng)7 d時(shí)換液。14 d后,終止培養(yǎng)。多聚甲醛固定后采用結(jié)晶紫染色,洗去染色液,空氣干燥。采用Image J測(cè)定克隆直徑,并計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1構(gòu)建 C3H10T1/2-Prdm14 過表達(dá)細(xì)胞株 采用Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建 C3H10T1/2-Prdm14 過表達(dá)細(xì)胞株,經(jīng)嘌呤霉素篩選后,Dox 誘導(dǎo) 48 h,可以在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,見圖 1A。進(jìn)一步采用 qRT-PCR 和WB分別檢測(cè) Prdm14 的 mRNA 和蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中 Prdm14 的 mRNA 和蛋白水平均明顯升高(P<0.05),見表2和圖1B、C。

注:A表示慢病毒感染細(xì)胞經(jīng)Dox誘導(dǎo)48 h后,綠色熒光蛋白表達(dá)情況; B表示不同組別細(xì)胞中Prdm14 mRNA表達(dá)情況;C表示不同組別細(xì)胞中Prdm14蛋白水平;實(shí)驗(yàn)組與空白組相比,*P<0.05;實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,#P<0.05。圖1 C3H10T1/2-Prdm14 過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定

表2 各組Prdm14 的 mRNA 和蛋白水平比較

2.2細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8檢測(cè)了陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較陰性對(duì)照組明顯增加(P<0.05),見圖2A。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但實(shí)驗(yàn)組平均克隆直徑增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2B和表3。

注:A表示細(xì)胞增殖能力情況;B表示細(xì)胞克隆形成能力情況;同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,*P<0.01。圖2 Prdm14高表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

表3 細(xì)胞克隆數(shù)和克隆直徑情況

2.3ALP檢測(cè) ALP檢測(cè)結(jié)果顯示:C3H10T1/2 過表達(dá) Prdm14 后,細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒(圖3A),其分泌的ALP活性[(20.76±0.52)個(gè)DEA酶活力單位]也較陰性對(duì)照組[(8.37±1.44)個(gè)DEA酶活力單位]明顯增加(P<0.05),見圖3B。

2.4干性因子表達(dá)檢測(cè) C3H10T1/2細(xì)胞中過表達(dá)Prdm14后,采用WB檢測(cè)主要干性因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組干性因子Sox2、Nanog蛋白水平均較陰性對(duì)照組升高(P<0.05),Oct4蛋白水平與陰性對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4和圖4。

注:A為WB檢測(cè)不同組別細(xì)胞中干性因子Sox2、Nanog以及Oct4蛋白水平;B為對(duì)A圖進(jìn)行灰度值量化結(jié)果;實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,*P<0.05。圖4 C3H10T1/2高表達(dá)Prdm14后干性因子的表達(dá)情況

表4 Sox2、Nanog以及Oct4蛋白水平變化情況

3 討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層未成熟的胚胎結(jié)締組織,是一類具有自我更新和多種分化潛能的成體干細(xì)胞,在特定情況下可誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞。作為優(yōu)選的組織工程種子細(xì)胞,在細(xì)胞替代治療、基因治療以及組織器官再造中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。C3H10T1/2細(xì)胞是由REZNIKOFF等[13]于1972年從C3H系小鼠胚胎分離建立的MSCs株,其形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣,也稱為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,它具有多能分化的功能,可向脂肪、骨、肌等分化[14-16]。在體外培養(yǎng)早期,未分化的MSCs可表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog和Sox2,但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),其增殖能力、分化潛能減弱,甚至檢測(cè)不到Oct4表達(dá)[17]。與之類似,本研究發(fā)現(xiàn),在C3H10T1/2細(xì)胞中,主要干性因子Sox2、Nanog、Oct4表達(dá)均不高;并且ESCs、PGCs 前體細(xì)胞等干性細(xì)胞表達(dá)的ALP在C3H10T1/2細(xì)胞也表現(xiàn)為陰性,這可能與MSCs經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)自身的干性減弱,發(fā)生自發(fā)性分化有關(guān)。離體培養(yǎng)的MSCs干細(xì)胞注入體內(nèi)后,其干性降低,往往不能按照預(yù)期的方向進(jìn)一步分化,進(jìn)而限制了其應(yīng)用。因此,干細(xì)胞干性的維持對(duì)其臨床應(yīng)用具有重要意義。

Prdm14為PRDM家族的重要成員,通過表觀遺傳學(xué)重編程、轉(zhuǎn)錄激活、抑制等過程,調(diào)節(jié)ESCs多能性、生殖細(xì)胞特化和發(fā)育[5,10,18-19],然而,Prdm14在MSCs中的表達(dá)及作用少見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),C3H10T1/2細(xì)胞中內(nèi)源性Prdm14水平較低,當(dāng)過表達(dá)Prdm14后,C3H10T1/2細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),ALP活性增加,表明Prdm14在一定程度上能提升C3H10T1/2細(xì)胞自我更新能力。OKASHITA等[12]報(bào)道,在外胚層樣細(xì)胞(EpiLCs)中,誘導(dǎo)Prdm14表達(dá)可上調(diào)干性相關(guān)基因。與之類似,本研究也發(fā)現(xiàn)Prdm14在C3H10T1/2細(xì)胞過表達(dá)能上調(diào)干性因子Sox2、Nanog的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)Prdm14對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞的干性具有一定的促進(jìn)作用。有研究顯示,Prdm14在多種腫瘤中表達(dá),能賦予癌細(xì)胞干性特性,促進(jìn)細(xì)胞生存及腫瘤發(fā)生[20]。但在本研究中,Oct4的表達(dá)并未明顯增加,細(xì)胞克隆數(shù)亦無(wú)明顯變化,表明Prdm14對(duì)于C3H10T1/2細(xì)胞干性的誘導(dǎo)是有限的,并不會(huì)導(dǎo)致其向腫瘤方向發(fā)展。

值得注意的是,Prdm14既能與Oct4、Sox2等基因位點(diǎn)結(jié)合,自身的位點(diǎn)又是Nanog、Sox2等的靶點(diǎn)[3]。因此,盡管Prdm14能促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞干性因子表達(dá),但其功能可能存在差異。在ESCs中,Prdm14與核心干性因子共同調(diào)控多能性相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò),抑制促分化基因,維持ESCs可塑狀態(tài)[18]。但在EpiLCs建立過程中,幼稚狀態(tài)的ESCs多能性網(wǎng)絡(luò)解體,EpiLCs的Nanog結(jié)合模式在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生了變化:ESCs中,Nanog結(jié)合多能性因子,促進(jìn)多能性狀態(tài),而EpiLCs中,Nanog結(jié)合并激活PGCs特化的關(guān)鍵因子Prdm1和Prdm14的增強(qiáng)子,進(jìn)而誘導(dǎo)EpiLCs分化為PGCLCs[21]。

Prdm14在不同細(xì)胞中發(fā)揮的作用不盡相同。C3H10T1/2細(xì)胞中,Prdm14過表達(dá)能促進(jìn)其增殖以及干性相關(guān)因子表達(dá)增加,但是否能進(jìn)一步向生殖系方向分化及其調(diào)控機(jī)制均值得進(jìn)一步深入研究。