鄒 昕,范小杰

1.江蘇省常州市中心血站輸血研究室,江蘇常州 213004;2.江蘇省常州市第一人民醫(yī)院檢驗科,江蘇常州 213004

自身免疫性溶血性貧血(AIHA)是指人類免疫功能紊亂產(chǎn)生抗自身紅細胞的抗體,與紅細胞表面的抗原相結(jié)合或激活補體使紅細胞壽命縮短的一種獲得性疾病。根據(jù)自身抗體不同,AIHA的自身抗體可分為溫抗體、冷抗體、溫冷抗體混合3種類型[1],其中溫冷抗體混合型比較少見。補體是先天免疫的主要參與者之一?？乖贵w復合物可以通過經(jīng)典途徑激活補體形成膜攻擊復合物導致紅細胞直接裂解或被肝脾捕獲參與溶血?，F(xiàn)對1例補體介導的溫冷自身抗體引起的AIHA鑒定過程報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者,女,72歲,2019年1月因貧血而輸注輻照洗滌紅細胞4 U,2022年2月5日因反復黃疸伴茶色尿6年余,重度貧血入院,血紅蛋白 56 g/L,網(wǎng)織紅細胞百分率1.8%,超敏C反應蛋白97.85 mg/L,總膽紅素23.5 μmol/L,直接膽紅素9.4 μmol/L,乳酸脫氫酶439 U/L,血糖21.7 mol/L,此次交叉配血中發(fā)現(xiàn)ABO血型鑒定困難,直接抗球蛋白試驗(DAT)陽性,遂送常州市中心血站輸血研究室進行交叉配血。

1.2儀器與試劑 抗-A/B單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司,批號:20191119);抗-D(IgM)單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司,批號:20200301101);ABO血型反定型紅細胞(北京金豪制藥股份有限公司,批號:20200701016);抗體篩選細胞(德國CE公司,批號:702101);譜細胞(德國CE公司,批號:732103; 荷蘭Sanquin公司,批號:8000453184);抗球蛋白凝膠卡(上海潤普生物技術有限公司,批號:10210801;長春博迅生物技術有限責任公司,批號:202100307/20211103);酸放散試劑盒(上海申型醫(yī)學科技有限公司,批號:20212101); 2-巰基乙醇 (2-Me,上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司,批號:20217701)。貝克曼高速離心機,久保田KA-2200血清學專用離心機;37 ℃/56 ℃恒溫水浴箱;配套卡式離心機。

1.3方法

1.3.1血清學檢測 采用試管法和微柱凝膠法檢測患者 ABO及 RhD血型,以及進行DAT、間接抗球蛋白試驗(IAT);在不同的條件下進行不規(guī)則抗體篩查(血清在56 ℃滅活、加入新鮮補體試驗,2-Me處理);應用譜細胞進行不規(guī)則抗體鑒定;采用等比稀釋法進行抗體效價檢測。所有試驗嚴格按照第18版AABB[2]和《輸血技術操作規(guī)程:輸血科部分》[3]操作規(guī)程進行操作。

1.3.2吸收放散試驗 患者自體細胞45 ℃放散至DAT陰性,再做自身吸收放散試驗。放散試驗按照酸放散試劑說明書進行操作。

1.3.3溫度依賴性補體結(jié)合試驗 采集ABO同型獻血者不抗凝和EDTA抗凝血標本,以獲得新鮮血清和紅細胞。取洗滌過的紅細胞20 μL(用生理鹽水配成50%的細胞懸液)在37 ℃和22 ℃恒溫下孵育15 min,將患者和供體的血清或血漿預熱至相同溫度,平衡溫度后,在預熱的紅細胞中加入100 μL患者血清和100 μL供體血清(含新鮮補體),相應溫度下孵育1、2、3、4、5、6、7、8 h觀察溶血情況[4]。

2 結(jié) 果

2.1血型血清學檢測 ABO血型血清學鑒定結(jié)果:鹽水介質(zhì)立即離心(IS),正定型A抗原與抗-A反應可達4+,B抗原與抗-B反應達1+,抗-D反應4+;反定型IS法均有凝集。溫鹽水洗滌患者紅細胞6次后繼續(xù)試驗,ABO正定型為A型;反定型在37 ℃孵育1 min后鑒定為A型。正反定型一致。

2.2DAT結(jié)果 直接試管法DAT試驗結(jié)果多抗和抗-C3d均為4+,抗-IgG為弱凝集。同時抗人球蛋白凝膠卡試驗結(jié)果多抗為4+,抗-IgG為2+。AB型血漿對照陰性。

2.3血清和血漿不同條件下抗體篩選結(jié)果 血清和血漿抗篩結(jié)果不一致,37 ℃恒溫孵育15 min 后凝集消失,2-Me處理IgM冷抗體后抗篩結(jié)果仍為陽性。自身對照始終為陽性。具體結(jié)果如表1。

血清在56 ℃孵育30 min滅活后做抗篩試驗,見表2,鹽水中抗篩結(jié)果全陽性,而IAT結(jié)果全為陰性。加入新鮮血清后,IAT結(jié)果又復為陽性?？贵w鑒定結(jié)果與抗篩結(jié)果一致,沒有特異性。

表2 血清補體試驗結(jié)果(試管法)

2.4抗體效價及性質(zhì)測定 原始血清用鹽水法在4 ℃時效價為256;在22 ℃時效價為16。2-Me處理血清用IAT法在37 ℃時效價為4。

2.5自身吸收和放散試驗 取45 ℃放散成DAT為陰性的患者紅細胞0.5 mL與自身血清在4 ℃、37 ℃吸收1 h,吸收后的血清抗篩結(jié)果為陰性,表明無其他特異性同種抗體。取未處理的0.5 mL患者壓積紅細胞進行酸放散試驗,在酸放散液中進行抗體篩選,結(jié)果IS和IAT試驗全陰性。

2.6溫度依賴性補體結(jié)合試驗 溫度依賴性補體結(jié)合試驗結(jié)果37 ℃組在試驗開始1 h出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,而22 ℃組在4 h出現(xiàn)溶血,兩組隨著時間的延長溶血程度均有增加。

3 討 論

臨床上AIHA患者體內(nèi),自身抗體和同種抗體往往同時存在且呈泛反應現(xiàn)象,此類患者大多數(shù)DAT呈陽性[5]。鑒別紅細胞上的抗體非常重要,該類患者若進行不相容輸血后,其自身抗體會對供者紅細胞產(chǎn)生致敏反應,且在補體作用下極易發(fā)生溶血現(xiàn)象。

結(jié)合本例患者病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查依據(jù),包括總膽紅素、直接膽紅素、乳酸脫氫酶等,均證明紅細胞有溶血現(xiàn)象。本案例DAT試驗證明以抗-C3d陽性為主。高效價的冷抗體致使紅細胞自凝,在溫鹽水洗滌以及37 ℃孵育后檢出患者血型為A型、RhD陽性。該患者原始血清和血漿抗篩結(jié)果截然相反,這是由于EDTA抗凝劑能夠結(jié)合Ca2+離子,抑制了補體的激活途徑,此抗體可能是具有廣譜特異性的自身抗體[6]。在實驗室檢測時把血清在56 ℃滅活30 min,IAT結(jié)果為陰性,而增加新鮮血清即補體,IAT結(jié)果又為陽性,這進一步證明補體介導抗體引起溶血[7]。在原始血清中的IAT(抗-IgG+抗-C3d、抗-IgG)均為陽性,與試管法結(jié)果一致。進一步嘗試證明補體介導的是冷抗體或溫抗體還是溫冷混合自身抗體引起的溶血。用2-Me破壞IgM抗體后再進行抗篩,結(jié)果凝集強度下降,說明補體介導了溫冷混合自身抗體引起溶血。該抗體在4 ℃時效價高達256,而37 ℃時(IAT法)效價為4,證明本例患者主要以冷抗體為主[8]。酸放散抗篩結(jié)果全為陰性,原因可能是IgM/IgG抗體量少,低于檢測閾值而未檢出或沒有,只有補體致敏紅細胞,今后可以考慮其他放散方法,如56 ℃熱放散等方法[9]。用自身抗體進行冷吸收后發(fā)現(xiàn)吸收后的血清抗體篩查陰性,進一步排除有同種抗體存在,且該自身抗體既有冷抗體的特性又有溫抗體的特性。AIHA患者如何輸注血液是關鍵。溫度依賴性補體結(jié)合試驗原理是在體外將患者血漿中的溶血相關抗體置于37 ℃和22 ℃充分致敏供者紅細胞,加入補體使其吸附于抗原抗體上,通過補體的激活作用在紅細胞膜上形成一個通道,使紅細胞內(nèi)的血紅蛋白溢出,發(fā)生溶血現(xiàn)象[10-13]。

本例患者溫度依賴性補體結(jié)合試驗在37 ℃和22 ℃配血均有溶血現(xiàn)象,說明患者體內(nèi)存在能與輸入紅細胞特異性結(jié)合的抗體,并且有補體特異性,存在輸入后產(chǎn)生血管內(nèi)急性溶血性輸血反應的因素,后來跟醫(yī)院協(xié)商患者暫時不輸血。此類患者只在血清中檢出抗體,而臨床上相當一部分醫(yī)院只用EDTA抗凝管的血漿進行抗體篩查和交叉配血,容易漏檢,輸血風險很大。如必須輸血的話盡量選擇常規(guī)配血加溶血試驗,降低溶血性輸血反應及其他不良反應的發(fā)生。