林艾和 朱培芳 李蓉 夏宗霄 龍小妹 郭爽 范源

【摘 要】 目的：優(yōu)選大花紫薇中三萜類化合物科羅索酸的最佳提取工藝。方法：采用 HPLC 建立大花紫薇中CA含量測定方法，以CA含量為評價指標，通過響應曲面法優(yōu)化工藝，考察乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)對CA提取效果的影響。結(jié)果：CA分離度良好，在0.480～2.880 μg （r＝0.9999）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為 99.97%（RSD＝0.58%）。最佳提取工藝條件為采用 95%乙醇、料液比為1∶20 g/mL、回流提取 60 min，提取 2 次。結(jié)論：本研究建立的方法結(jié)果準確、重復性好，可用于合理優(yōu)化大花紫薇中CA的提取工藝。

【關(guān)鍵詞】 大花紫薇；Box-Benhnken；提取工藝；科羅索酸

【中圖分類號】R284.2?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）01-0037-06

Box-Behnken Response Surface Methodology for Optimization of Extraction Process of Corosolic Acid from Lagerstroemia speciosa

LIN Aihe1 ZHU Peifang1 LI Rong1 XIA Zongxiao1 LONG Xiaomei1 GUO Shuang1 FAN Yuan1，2*

1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2.Yunnan University of Chinese Medicine/Second Affiliated Hospital of Yunnan College of

Traditional Chinese Medicine， Kunming 650216， China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of Corosoic acid from Crape Myrcus macrophylla. Methods HPLC was used to establish a method for the determination of Ca content in Cryptophylla grandiflorum. With Ca content as the evaluation index， response surface methodology was used to optimize the process. The effects of ethanol volume fraction， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times on the extraction efficiency of Ca were investigated. Results The Ca separation was linear in the range of 0.480-2.880 μg （r=0.9999）.The average recovery was 99.97% （RSD = 0.58%）. The optimal extraction conditions were as follows： 95% ethanol， liquid to solid ratio of 1∶20 g/mL， reflux extraction for 60 min， extraction twice.Conclusion The method established in this study was accurate and reproducible， and could be used to optimize the extraction process of CA from Crape Myrrh macrophylla.

Keywords：Lagerstroemia speciosa; Box-Behnken; Extraction Process; Corosolic Acid

大花紫薇（Lagerstroemia specious L.），又名大葉紫薇（Lagerstroemia flos-reginae Retz），是千屈菜科（Lythraceae）紫薇屬（Lagerstroemia）的落葉喬木［1］。其原產(chǎn)于亞洲熱帶，分布于斯里蘭卡、印度、馬來西亞、菲律賓等地區(qū)［2］，在我國廣東、廣西地區(qū)有較豐富的資源。

上世紀90年代起，日本、美國以及菲律賓學者開始系統(tǒng)研究大花紫薇化學成分及功能［3］，其廣泛用于治療糖尿病及腎?。?］，在多個國家已經(jīng)被開發(fā)為茶飲料，廣泛用于治療和預防糖尿病，被譽為“天然植物胰島素”［5］，此外，其還具有減脂、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等作用［6］。近年來，隨著對大花紫薇的研究深入，發(fā)現(xiàn)其降血糖的活性成分主要是鞣質(zhì)類［5，7-8］和三萜類成分［9-10］，其中三萜類主要活性成為科羅索酸［11］，其具有胰島素樣作用且可抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶活性［12-14］。

科羅索酸（corosolic acid，CA），又名 2α-羥基熊果酸［15］，具有降血糖、改善糖尿病性腎損傷、抗腫瘤、抗炎、降血壓、抗菌等藥理作用［16-19］。其主要存在于大花紫薇、枇杷、北五味子等植物中［20］，現(xiàn)關(guān)于在大花紫薇中提取CA相關(guān)報道較少，本實驗研究建立大花紫薇中CA HPLC 定量分析方法，同時采用響應曲面法優(yōu)化其提取工藝，為在大花紫薇中提取CA的工藝研究和對大花紫薇的后續(xù)開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 YL-040S 語路超聲波清洗機，深圳市即潔超聲科技有限公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀，DAD檢測器，AcclaimC30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），美國 Agilent 公司；DFY-600 搖擺式高速萬能粉碎機，永康式速鋒工貿(mào)有限公司；D2KW-D 電熱恒溫水浴鍋，上海量壹科學儀器有限公司；T-1000 型電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；AB265-S 十萬分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade（Shanghai）Co.LTD；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司。

試劑：科羅索酸（CA 批號：wkq20042404，純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

藥材：大花紫薇Lagerstroemia specious L.（批號：P20200819，安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司）經(jīng)云南中醫(yī)藥大學李國棟副教授鑒定為千屈菜科Lythraceae紫薇屬Lagerstroemia植物大花紫薇的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：AcclaimC30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動相：甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸水溶液（D）；梯度洗脫：0 ～10 min 75% B，12.5% C，12.5% D；10～20 min 70% B，15% C，15% D；流速：0.1 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按科羅索酸計算應不低于 5000，分離度大于1.5。色譜圖如圖1所示。

2.1.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取CA對照品2.40 mg，置 10 mL 量瓶中，用甲醇配制成CA濃度分別為0.240 mg/mL 的混合對照品溶液，低溫避光保存。

2.1.3 供試品溶液制備 取干燥的大花紫薇，粉碎，過 40 目篩，精密稱定約 2.0 g，置于圓底燒瓶中，加熱回流，提取溫度90℃，設置不同料液比、加熱回流時間、回流次數(shù)及乙醇體積分數(shù)，合并提取液，過濾。濾液于 60 ℃減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解后移至 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜膜過濾，依次精密吸取2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL， 按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。 CA的回歸方程為y=604.24x+1.1333（R2=0.9999），線性范圍為 0.480～2.880 μg。

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液 10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣 6 次，結(jié)果CA的峰面積RSD 為1.13% ，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，按“2.1.1”項下色譜條件，以峰面積為指標進樣分析，結(jié)果CA面積 RSD 為1.44%，表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批樣品 6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果顯示CA平均含量為2.3246 mg/g， RSD 為 1.28%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品（每 1.0 g 大花紫薇含CA 2.3246mg）粉末 6份，每份精密稱取 1.0 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，加入CA對照品適量（約相當于 1.0 g 樣品中所含CA的量），再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率。結(jié)果見表 1。

2.2 單因素實驗 采用加熱回流法提取大花紫薇中的科羅索酸，將料液比、加熱回流時間、回流次數(shù)及乙醇體積分數(shù)作為影響因素，固定其中3個因素，以提取率為評價指標，對另一個因素進行單一因素實驗。固定提取時間為60 min，提取次數(shù)為1次，料液比為1∶10 g/mL，考察乙醇體積分數(shù)（75%、80%、85%、95%、100%）對提取率的影響，優(yōu)選最佳乙醇體積分數(shù)，按所優(yōu)選條件依次向下考察料液比（1∶10 g/mL、1∶15g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL），提取時間（40 min、60 min、80 min、100 min、120 min），提取次數(shù)（1次、2次、3次）對醇提的影響。

結(jié)果圖2表明，CA含量隨乙醇體積分數(shù)升高而增加，由于CA是脂溶性物質(zhì)，不溶于水，隨著乙醇體積分數(shù)的增加其含量增加，當乙醇體積分數(shù)為95%和100%時，CA含量相差不明顯，考慮實驗成本，故選擇乙醇體積分數(shù)為 95%［21］；CA含量隨料液比從1∶10 g/mL到1∶25 g/mL先增加后減少，可能因為為溶劑體積過小，CA無法徹底溶解，但溶劑體積過大，更易溶出其他的雜質(zhì)達到飽和［22］，繼續(xù)增大料液比不會增加溶出率，故選擇料液比 1∶20 g/mL；CA含量隨提取時間從40～120 min先增加后減少，CA溶出率一定時間內(nèi)隨著提取時間增加增加，但提取時間過長，料液長時間處于受熱狀態(tài)，更容易造成CA損失，固選擇提取時間60 min［23］；CA含量在提取次數(shù)2次時最大，故選擇提取次數(shù)兩次。最佳條件為乙醇體積分數(shù)95%，料液比1∶20 g/mL，提取時間60 min，提取次數(shù)2次。

活性物質(zhì)含量（mg/g）計算公式：

含量=M供×C標/M對

式中M供為供試品峰面積；

C標為標準品的濃度（mg/mL）

M對為標準品峰面積

2.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化醇提工藝

2.3.1 響應曲面試驗設計及結(jié)果 依據(jù)Box-Behnken響應面試驗設計原理，結(jié)合上述醇提單因素試驗結(jié)果，進行因素水平設計與試驗。因素水平見表2，結(jié)果見表3。

2.3.2 醇提模型擬合及方差分析 采用Design-expert 8.0.6軟件對表2中的試驗結(jié)果進行分析，得到回歸方程為

Y=-51.15554+0.94402A+0.40383B+0.13185C+0.72244D-6.7×10-4AB-1.17133×10-3AC+4×10-3AD-3.17333×10-4BC-0.0197BD+2.25917×10-4CD-4.58348×10-3A2-6.60648×10-3B2-1.2384×10-4C2-0.15528D2 R2=0.9158。由表3可知，模型F＝10.87（P＜0.0001），表明回歸模型極顯著，失擬項F＝2.03，P＝0.2584＞0.05，表明模型失擬項不顯著，可用于分析試驗數(shù)據(jù)。以Y為響應值時，模型的一次項影響順序是D＞B＞C＞A，和二次項B2、D2有極顯著影響（P＜0.001），一次項D和二次項A2、C2有高度顯著影響（P＜0.01），一次項B、C有顯著影響（P＜0.05）表明所得回歸方程能較好地預測Y隨各影響因子的變化。見表4。

2.3.3 醇提響應面優(yōu)化及預測 經(jīng)Design-expert 8.0.6軟件分析得響應面圖（如圖3所示），由圖可見提取次數(shù)對Y值影響較大，交互項對Y值無顯著影響，忽略交互作用，以Y值的回歸模型的極值分析得到最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分數(shù)94.77%，提取時間60 min，提取次數(shù)2.27次，料液比1∶20.93 g/mL，Y預測值為2.5783 μg/g，綜合實際情況考慮，調(diào)整最優(yōu)提取條件為乙醇體積分數(shù)95%，提取時間60 min，提取次數(shù)2次，料液比1∶20 g/mL。如圖3所示。

2.4 醇提優(yōu)化工藝驗證試驗 平行稱取大花紫薇3份，每份2.0 g，按所優(yōu)化條件進行驗證試驗。結(jié)果顯示Y平均值為2.5613 mg/g（RSD=1.33％，n＝3），與預測值2.5783 mg/g相比較，相對誤差為1.20％，說明該模型預測性擬合度良好，所得數(shù)據(jù)有效可靠。見表5。

3 討論

3.1 色譜條件 本實驗經(jīng)反復試驗，調(diào)整甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液三者的比例，最終選用流動相甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸水溶液（D），梯度洗脫，分離度＞1.5，達到了檢測要求。大花紫薇中科羅索酸的加熱回流提取最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)95%，提取時間60 min，提取次數(shù)2次，料液比1∶20 g/mL。實驗結(jié)果表明，最佳提取方法所得科羅索酸含量為2.5613 mg/g，擬合的模型能較為準確地預測總含量，同時也說明響應面分析法精確度高、模型預測性好。

3.2 結(jié)果分析 本試驗以科羅索酸為指標成分，用Box-Benhnken響應曲面法優(yōu)化大花紫薇中CA的提取工藝，經(jīng)工藝驗證實驗證明，該提取工藝操作簡單，CA的提取率高，節(jié)省溶劑且穩(wěn)定性好，是應用前景較好的提取方法之一，可為后續(xù)CA的應用提供參考。

3.2 展望 科羅索酸具有顯著的降血糖作用，且對身體毒副作用較小，是一種較為理想的降糖化合物，數(shù)據(jù)表明大花紫薇是一種科羅索酸的含量較高的天然藥用植物，尋找在其中有效提取CA的方法是很有必要的，后續(xù)的研究可以在此文章的基礎上，從藥效、作用機制的角度來探討中藥資源的合理開發(fā)。

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（收稿日期：2022-05-07 編輯：陶希睿）