李依陽(yáng) 鄺日禹 張 濤 蘇曉琳 雷玲艷 覃 凱 譚妍妍

(1 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣西南寧市 530001; 2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第923醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣西南寧市 530021)

對(duì)比劑腎病(contrast-induced nephropathy,CIN)是由對(duì)比劑引起的急性腎損傷,即應(yīng)用對(duì)比劑后新發(fā)生的腎功能障礙或者原有腎功能障礙加重[1],其發(fā)病機(jī)制涉及對(duì)比劑的直接毒性作用、腎臟灌注改變、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等[2]。CIN是冠心病介入治療的常見并發(fā)癥,其在高風(fēng)險(xiǎn)人群(如糖尿病、慢性心力衰竭、慢性腎損害、老年)中的發(fā)生率可高達(dá) 20%～30%[3],是繼低容量繼發(fā)性腎病、藥物性腎損傷后的第三大醫(yī)源性腎病[4]。CIN一般在使用對(duì)比劑后24～48 h內(nèi)發(fā)生,目前針對(duì)預(yù)防CIN的藥物研究主要集中在N-乙酰半胱氨酸、抗氧化劑、前列腺素E1、腺苷受體抑制劑、低劑量多巴胺、鈣拮抗劑等,但是尚無明確的證據(jù)支持這些藥物的治療效果和有效劑量[5],如何有效防治CIN是亟待解決的重要問題。 達(dá)格列凈屬于鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑,能有效地抑制腎小管鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2受體,非胰島素依賴性地降低血糖水平。除了降低血糖水平,其還可以通過抗感染、抗氧化應(yīng)激、改善線粒體功能、調(diào)節(jié)自噬等途徑降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),并具有良好的腎臟保護(hù)作用[6-7]。但達(dá)格列凈對(duì)對(duì)比劑相關(guān)急性腎損傷的作用尚不清楚。本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明達(dá)格列凈可以改善CIN大鼠模型的腎功能,本研究主要分析達(dá)格列凈預(yù)處理對(duì)CIN大鼠炎癥因子及腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響,以探討其改善CIN大鼠腎功能的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只無特定病原體級(jí)SD雄性大鼠,體重180～220 g,6～8周齡,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010]。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～25 ℃,濕度為40%～60%,自由進(jìn)食飲水。12 h光暗循環(huán)。

1.2 藥物、儀器與試劑

1.2.1 藥物:達(dá)格列凈(AstraZeneca公司,批號(hào):LP2385),吲哚美辛、左旋硝基精氨酸甲酯(上海麥克林生化科技股份有限公司,批號(hào):c13012144、c11022979),碘海醇注射液(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,批號(hào):KT6A7S)。

1.2.2 主要試劑:白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào):A201B11115),髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20211123),TUNEL試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):101322230120),DAPI染色液(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):18c20b77),核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)抗體(Abcam公司,批號(hào):GR3369573-8),cleaved Caspase-3、Caspase-3抗體(Novus Biologicals公司,批號(hào):G-2),β-actin抗體(Affinity BioReagents公司,批號(hào):54O2802),山羊抗鼠二抗、熒光二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào):220030406、201811125),ECL試劑盒(Affinity BioReagents公司,批號(hào):7525a27)。

1.2.3 主要儀器:Multiskan Sky型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司),UC90型奧林巴斯成像系統(tǒng)(OLYMPUS公司),BX43型熒光顯微鏡( OLYMPUS公司),半干轉(zhuǎn)膜儀(ATTO公司),電泳儀(北京六一生物科技有限公司),FluorChem R型多功能成像分析系統(tǒng)(ProteinSimple公司),DS-11 型超微量紫外可見分光光度計(jì)(Denovix公司)。

1.3 分組、CIN大鼠模型的建立及干預(yù)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、達(dá)格列凈組,每組6只。在各組大鼠禁水24 h、禁食過夜后,給予模型組、達(dá)格列凈組尾靜脈注射吲哚美辛10 mg/kg(將吲哚美辛溶于二甲基亞砜制成濃度為10 mg/mL的溶液,再用1.25%的碳酸氫鈉將其稀釋10倍,注射劑量為10 mL/kg),15 min 后尾靜脈注射左旋硝基精氨酸甲酯10 mg/kg(將左旋硝基精氨酸甲酯溶于生理鹽水,注射劑量為10 mL/kg),15 min 后尾靜脈注射碘海醇注射液(1 600 mg/kg)[1],給予正常組尾靜脈注射生理鹽水(10 mL/kg)3次,每次間隔15 min。血肌酐水平在對(duì)比劑暴露后24～48 h增加≥25%或較其基礎(chǔ)值升高≥0.5 mg/dL[8-9],則提示造模成功。本研究的模型組、達(dá)格列凈組大鼠均造模成功。于造模前2 h,給予達(dá)格列凈組大鼠灌胃達(dá)格列凈1 mg/kg(生理鹽水溶解,給藥體積為10 mL/kg),給予正常組、模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg。

1.4 標(biāo)本采集 造模后24 h,通過腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉各組大鼠,將其仰臥固定,開腹后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL,待血凝固后在4 ℃下以3 500 r/min離心10 min制備血清。采血后將大鼠冰浴并迅速取出兩側(cè)腎臟,一側(cè)用10%福爾馬林固定,另一側(cè)用濾紙吸干水分后置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.5 血清IL-1β含量及腎組織MPO含量的檢測(cè) 按ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)大鼠血清IL-1β含量。取部分凍存的腎臟組織,按照試劑盒說明書步驟制備腎組織勻漿,檢測(cè)大鼠腎臟組織MPO含量。

1.6 腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 將用10%福爾馬林固定的腎臟組織依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水,按TUNEL試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作,然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照,呈綠色的細(xì)胞為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,隨機(jī)選取3個(gè)視野(×200),以腎小管上皮凋亡陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比值作為腎小管上皮細(xì)胞凋亡率。

1.7 腎臟組織NLRP3表達(dá)水平的檢測(cè) 將用10%福爾馬林固定的腎臟組織依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水,抗原熱修復(fù),封閉,孵育NLRP3抗體(稀釋比例為1 ∶120,4 ℃孵育過夜)、熒光二抗(稀釋比例為1 ∶200,37 ℃孵育30 min),DAPI 染核,封片。在熒光顯微鏡下觀察并照相,使用Image J 軟件分析并計(jì)算平均光密度值。

1.8 腎臟組織cleaved Caspase-3、Caspase-3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 取部分凍存的腎臟組織,將腎臟組織稱重后加入適量RIPA裂解液,于冰上研磨,4 ℃下以12 000 r/min離心10 min后取上清液,使用超微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品配成上樣緩沖液并加熱變性,經(jīng)10%SDS-PAGE分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂牛奶封閉后分別放入cleaved Caspase-3(稀釋比例為1 ∶2 000)、Caspase-3(稀釋比例為1 ∶2 000)和β-actin一抗(稀釋比例為1 ∶3 000)工作液中4 ℃反應(yīng)過夜,將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入山羊抗鼠二抗(稀釋比例為1 ∶3 000)工作液中孵育90 min,洗膜,經(jīng)ECL液曝光顯影,用Image J軟件分析各組樣品的光密度值,以目的蛋白光密度值/內(nèi)參蛋白光密度值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,然后計(jì)算cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平與Caspase-3蛋白表達(dá)水平的比值(以下簡(jiǎn)稱cleaved Caspase-3與Caspase-3比值)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠血清IL-1β含量和腎臟組織MPO含量的比較 模型組和達(dá)格列凈組大鼠的血清IL-1β含量均較正常組升高,而達(dá)格列凈組大鼠的血清IL-1β含量較模型組降低(均P<0.05)。3組大鼠腎臟組織的MPO含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清IL-1β含量和腎臟組織MPO含量的比較(x±s)

2.2 3組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的比較 模型組和達(dá)格列凈組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率均較正常組升高,而達(dá)格列凈組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率較模型組降低(均P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 3組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×200)

表2 3組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的比較(x±s,%)

2.3 3組大鼠腎臟組織NLRP3表達(dá)水平的比較 模型組和達(dá)格列凈組大鼠腎臟組織的NLRP3表達(dá)水平均較正常組升高,而達(dá)格列凈組大鼠腎臟組織的NLRP3表達(dá)水平較模型組降低(均P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 3組大鼠腎臟組織NLRP3表達(dá)情況(免疫熒光染色,×200)

表3 3組大鼠腎臟組織NLRP3表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 3組大鼠腎臟組織cleaved Caspase-3與Caspase-3比值的比較 模型組和達(dá)格列凈組大鼠腎臟組織的cleaved Caspase-3與Caspase-3比值均較正常組升高,達(dá)格列凈組大鼠腎臟組織的cleaved Caspase-3與Caspase-3比值較模型組降低(均P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 4組大鼠腎臟組織cleaved Caspase-3、Caspase-3表達(dá)情況

表4 3組大鼠腎臟組織cleaved Caspase-3與Caspase-3比值的比較(x±s)

3 討 論

CIN的病理生理學(xué)較為復(fù)雜,炎癥反應(yīng)是CIN病理機(jī)制的重要組成部分,炎癥反應(yīng)可能發(fā)生在最初的低氧和活性氧簇介導(dǎo)的腎臟損傷之后,形成炎癥、血管損傷和缺氧的正反饋循環(huán)[5,10]。IL-1β是IL-1家族的重要成員,在局部和全身均能發(fā)揮作用,可在外周血中檢測(cè)到[11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),對(duì)比劑誘導(dǎo)急性腎損傷發(fā)生時(shí)炎癥細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)水平明顯升高[5,12]。因此,檢測(cè)IL-1β的表達(dá)水平既可以發(fā)現(xiàn)早期腎臟炎性損傷,又可以預(yù)估腎臟損傷進(jìn)展,對(duì)評(píng)估急性腎損傷具有重要意義[13]。本研究結(jié)果顯示,CIN大鼠血清IL-1β含量升高,提示CIN大鼠體內(nèi)存在炎癥反應(yīng);給予達(dá)格列凈預(yù)處理后大鼠血清IL-1β含量降低,表明達(dá)格列凈可降低IL-1β表達(dá)從而減輕損傷組織的炎癥反應(yīng)。MPO是一種催化過氧化物還原的酶,是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞氧依賴性殺菌系統(tǒng)的重要組分,MPO水平與中性粒細(xì)胞激活程度具有相關(guān)性[14]。本研究中,CIN大鼠腎臟組織MPO含量有增高趨勢(shì),但與其他兩組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與樣本量較小有關(guān)。

炎性小體是自身免疫和無菌性炎癥反應(yīng)中的核心成員,在感知炎癥引起的初始損傷后,自動(dòng)鏈接機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)通路[15-16]。NLRP3炎性小體的激活是各種炎癥產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),各種細(xì)菌毒素、環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)均可觸發(fā)NLRP3炎性小體信號(hào)通路。NLRP3被激活后發(fā)生寡聚化,招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白,該蛋白再與Caspase-1前體結(jié)合并誘導(dǎo)其自身裂解為成熟的Caspase-1后,組成一個(gè)可催化IL-1β、IL-18成熟的平臺(tái),即炎性小體[17]。本研究結(jié)果提示,CIN大鼠腎臟組織的NLRP3表達(dá)增多,而達(dá)格列凈可抑制NLRP3的表達(dá),表明達(dá)格列凈預(yù)處理可能通過抑制NLRP3炎性小體通路的活性來減輕CIN大鼠的炎癥反應(yīng)。

對(duì)比劑所造成的腎小管上皮細(xì)胞過度凋亡是CIN發(fā)生的中心環(huán)節(jié)之一[18]。本研究通過TUNEL免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示CIN大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高,提示對(duì)比劑可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡;而給予達(dá)格列凈干預(yù)后大鼠的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率下降,提示達(dá)格列凈預(yù)處理對(duì)減輕對(duì)比劑引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡有積極的作用。

細(xì)胞凋亡是受基因控制的細(xì)胞自發(fā)性死亡。雖然細(xì)胞凋亡的途徑各不相同,但最終都會(huì)由Caspase家族介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來執(zhí)行最后的凋亡過程。Caspase-3位于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游,是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的執(zhí)行因子[19],當(dāng)細(xì)胞受到各種不同凋亡因素刺激時(shí),通過多個(gè)途徑均能夠激活反應(yīng)下游的Caspase-3從而引起細(xì)胞凋亡,Caspase-3活化后細(xì)胞凋亡的結(jié)局將不可逆轉(zhuǎn)。研究證實(shí),在CIN模型大鼠中,腎臟組織Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)、活化明顯增強(qiáng),細(xì)胞凋亡明顯增加[17]。本研究結(jié)果顯示,CIN大鼠腎臟組織的cleaved Caspase-3與Caspase-3比值升高,說明CIN發(fā)生后Caspase-3活化增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加;而使用達(dá)格列凈預(yù)處理可降低cleaved Caspase-3與Caspase-3比值,說明達(dá)格列凈可能通過抑制Caspase-3活化從而減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述,達(dá)格列凈預(yù)處理可能通過抑制NLRP3炎性小體通路的活性和炎癥因子的表達(dá)來減輕CIN大鼠的炎癥反應(yīng),并通過抑制Caspase-3活化來減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。