勞芝英 凌 媚 黃婉茸 彭 艷 吳聰穎

(防城港市第一人民醫(yī)院婦科,廣西防城港市 538021)

宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesion,SIL)是臨床上常見(jiàn)的婦科疾病,是宮頸癌前病變,具有癌變風(fēng)險(xiǎn)[1]。宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)包括宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí),主要由高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染后引起。目前臨床上治療宮頸HSIL首選宮頸環(huán)形電切術(shù)(loop electrosurgical excision procedure,LEEP)。盡管宮頸LEEP創(chuàng)傷小、可保留患者子宮和生育功能,但是術(shù)后存在病變殘存及復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),因此,了解宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)情況及其影響因素對(duì)改善患者預(yù)后具有積極意義[2]。著絲粒蛋白F(centromere protein F,CENP-F)可通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂、惡性增殖,在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。研究顯示,CENP-F在宮頸上皮呈現(xiàn)高表達(dá),且其表達(dá)水平隨著SIL級(jí)別的增加而升高,可以反映SIL的嚴(yán)重程度[3]。微管不穩(wěn)定蛋白Stathmin在細(xì)胞質(zhì)中廣泛存在,其可結(jié)合多種蛋白調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路,參與細(xì)胞的增殖、分化等[4]。研究發(fā)現(xiàn),Stathmin蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá),且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[5],Stathmin在SIL患者中也呈現(xiàn)高表達(dá)[6],但是其與宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的關(guān)系如何目前鮮見(jiàn)報(bào)告。為此,本研究檢測(cè)宮頸HSIL患者病變組織Stathmin、CENP-F的表達(dá)情況,并分析其預(yù)測(cè)宮頸LEEP后疾病復(fù)發(fā)的價(jià)值,以期為臨床評(píng)估宮頸HSIL患者行宮頸LEEP后的預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2018年1月至2020年1月我院收治的120例行宮頸LEEP治療的宮頸HSIL患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡均≥18歲,女性,有性行為史;經(jīng)過(guò)宮頸組織病理學(xué)檢查確診為SIL;病變分級(jí)均為宮頸HSIL;進(jìn)行宮頸LEEP治療,存檔病理組織樣本滿(mǎn)足檢測(cè)需求;隨訪資料及臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后被確診為宮頸癌浸潤(rùn);有放化療史;合并其他組織器官惡性腫瘤;有神經(jīng)系統(tǒng)疾病。患者年齡23～71(41.28±5.98)歲;孕次0～5(2.23±1.00)次;產(chǎn)次0～3(1.19±0.21)次。

1.2 方法

1.2.1 收集患者一般資料:收集患者的年齡、孕次、產(chǎn)次、月經(jīng)狀態(tài)、絕經(jīng)情況、生育情況、手術(shù)方式、高風(fēng)險(xiǎn)(high risk,HR)-HPV感染情況、病變分級(jí)、切緣狀態(tài)、病理結(jié)果、HPV持續(xù)感染情況、腺體是否受累及受累象限等[7]。

1.2.2 檢測(cè)Stathmin、CENP-F陽(yáng)性表達(dá)情況:采用免疫組化法檢測(cè)Stathmin、CENP-F陽(yáng)性表達(dá)情況。取宮頸HSIL患者術(shù)后組織標(biāo)本切片放置于含有3% H2O2的去離子水中孵育5 min,PBS沖洗3次。滴加Stathmin抗體(上海滬震生物科技有限公司,批號(hào):20171123)、CENP-F抗體(上海研生實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):YS170722)至切片上(稀釋比均為1 ∶100),于37 ℃孵育2 h,PBS沖洗3次。滴加通用型IgG抗體-表皮生長(zhǎng)因子受體多聚體(Imgenex公司,批號(hào):171004),置于37 ℃孵育15 min,PBS沖洗3次。將二氨基聯(lián)苯胺工作液(中杉金橋公司,批號(hào):20171123)滴加至切片上并于顯微鏡下顯色,用自來(lái)水終止顯色反應(yīng)。采用蘇木素復(fù)染,常規(guī)酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠固封。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗,其余步驟與上述相同。陽(yáng)性對(duì)照采用已有的陽(yáng)性切片。(1)Stathmin結(jié)果判定。Stathmin定位于細(xì)胞質(zhì),胞質(zhì)為棕黃色、棕褐色、淡黃色表示染色陽(yáng)性。在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察細(xì)胞著色情況,采用雙評(píng)分半定量法判斷陽(yáng)性細(xì)胞百分率和陽(yáng)性細(xì)胞的染色深度。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分如下,>75%細(xì)胞著色為4分,51%～75%細(xì)胞著色為3分,26%～50%細(xì)胞著色為2分,5%～25%細(xì)胞著色為1分,<5%細(xì)胞著色為0分。染色深度評(píng)分如下,棕黃色為3分,棕褐色為2分,淡黃色為1分,未見(jiàn)染色為0分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞染色深度評(píng)分之和作為最終評(píng)分,評(píng)分范圍0～7分,評(píng)分≥2分為Stathmin陽(yáng)性表達(dá),評(píng)分<2分為Stathmin陰性表達(dá)。(2)CENP-F結(jié)果判定。CENP-F定位于細(xì)胞核,細(xì)胞核見(jiàn)棕色、棕黃色、淡黃色顆粒記為陽(yáng)性。根據(jù)染色的程度和強(qiáng)度兩方面進(jìn)行評(píng)估,染色程度即陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分如下,>50%細(xì)胞著色為4分,26%～50%細(xì)胞著色為3分,11%～25%細(xì)胞著色為2分,1%～10%細(xì)胞著色為1分,無(wú)細(xì)胞著色為0分;染色強(qiáng)度評(píng)分如下,棕色顆粒為3分,棕黃色顆粒為2分,淡黃色顆粒為1分,無(wú)染色為0分。將染色程度和染色強(qiáng)度評(píng)分之和作為CENP-F總評(píng)分,評(píng)分范圍0～7分,評(píng)分≥3分表示CENP-F陽(yáng)性表達(dá),<3分表示CENP-F陰性表達(dá)。

1.2.3 隨訪及觀察指標(biāo):術(shù)后隨訪時(shí)間24～33個(gè)月,宮頸HSIL患者分別于術(shù)后3、6、12、24個(gè)月復(fù)查,包括HPV感染情況及薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查(thinprep cytologic test,TCT)。若患者隨訪期間復(fù)查CT異常,且宮頸活檢結(jié)果顯示SIL則為復(fù)發(fā)。若患者術(shù)前HR-HPV結(jié)果為陽(yáng)性,且術(shù)后6個(gè)月的復(fù)查結(jié)果仍顯示HPV陽(yáng)性,則表示HPV持續(xù)感染。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示,比較采用χ2檢驗(yàn);符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示,比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。采用多因素COX回歸模型分析確定宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素;采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析;采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線(xiàn)分析Stathmin和CENP-F對(duì)宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸HSIL患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況 120例宮頸HSIL患者的隨訪時(shí)間為24～33個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為24個(gè)月。隨訪期間共有25例患者復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)率為20.83%。根據(jù)隨訪期間患者的復(fù)發(fā)情況,將患者分為復(fù)發(fā)組25例和未復(fù)發(fā)組95例。

2.2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者術(shù)后Stathmin、CENP-F表達(dá)情況的比較 復(fù)發(fā)組患者Stathmin和CENP-F陽(yáng)性表達(dá)率均高于未復(fù)發(fā)組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者術(shù)后Stathmin、CENP-F表達(dá)情況的比較[n(%)]

2.3 宮頸HSIL患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的單因素分析 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組宮頸HSIL患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、絕經(jīng)狀態(tài)和孕次比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組患者的產(chǎn)次、切緣狀態(tài)、病理結(jié)果、HR-HPV種類(lèi)數(shù)、腺體受累情況、受累象限個(gè)數(shù)、HPV持續(xù)感染情況、Stathmin表達(dá)情況和CENP-F表達(dá)情況比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 單因素分析結(jié)果(n)

2.4 宮頸HSIL患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的多因素分析 以宮頸HSIL患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)為因變量,以單因素分析中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量(變量賦值情況見(jiàn)表3),納入多因素COX回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,切緣陽(yáng)性、HR-HPV種類(lèi)數(shù)≥2種、腺體受累、受累象限>3個(gè)、HPV持續(xù)感染、Stathmin陽(yáng)性表達(dá)及CENP-F陽(yáng)性表達(dá)均是宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 賦值情況

表4 多因素COX回歸分析結(jié)果

2.5 Stathmin和CENP-F相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示,Stathmin評(píng)分與CENP-F評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.673,P<0.05)。

2.6 Stathmin評(píng)分和CENP-F評(píng)分對(duì)宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示,Stathmin評(píng)分預(yù)測(cè)宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的曲線(xiàn)下面積為0.843(95%CI:0.766,0.885;P<0.001), CENP-F評(píng)分預(yù)測(cè)宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的曲線(xiàn)下面積為0.865(95%CI:0.822,0.900;P<0.001);約登指數(shù)取最大值時(shí),Stathmin評(píng)分和CENP-F評(píng)分的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.01分和3.03分, Stathmin評(píng)分預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的靈敏度和特異度分別為73.28%和62.49%,CENP-F評(píng)分預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的靈敏度和特異度分別為75.32%和64.18%。見(jiàn)圖1。

圖1 Stathmin評(píng)分和CENP-F評(píng)分預(yù)測(cè)宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的ROC曲線(xiàn)

3 討 論

近年來(lái),SIL發(fā)病率有上升趨勢(shì),且發(fā)病呈年輕化,有發(fā)展成宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn),積極治療可以降低癌變的風(fēng)險(xiǎn)[8]。宮頸LEEP是目前臨床上治療宮頸HSIL的首選療法,操作簡(jiǎn)單,對(duì)患者的創(chuàng)傷較小,有助于患者術(shù)后康復(fù),且可以保留患者的子宮和生育功能,但由于手術(shù)過(guò)程中病變組織不易完全切除,因此術(shù)后仍然存在復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[9]。有研究顯示,宮頸HSIL患者宮頸LEEP后,病灶殘留/復(fù)發(fā)率可達(dá)3%～47%[10]。本研究結(jié)果顯示,宮頸LEEP后隨訪期間患者的復(fù)發(fā)率為20.83%,與既往研究結(jié)果相似。

Stathmin又稱(chēng)原癌基因蛋白 18,廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等。Stathmin的組成包括中心區(qū)、蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域(C端)和結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)域(N端),也屬于微管相關(guān)蛋白,對(duì)微管的解聚有一定的調(diào)節(jié)作用,因此又被稱(chēng)為微管不穩(wěn)定蛋白。此外,Stathmin還可以與多種蛋白調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路結(jié)合,對(duì)細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]。研究顯示,Stathmin在食管鱗癌、喉部鱗狀細(xì)胞癌、胃癌等多種腫瘤中都呈現(xiàn)高表達(dá)[12]。CENP-F主要分布于細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞著絲粒區(qū),參與細(xì)胞著絲粒的構(gòu)成,其在細(xì)胞G2/M期呈現(xiàn)高表達(dá),而在細(xì)胞分裂的末期被快速水解,CENP-F在細(xì)胞周期中的特異性表達(dá)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,影響細(xì)胞增殖,同時(shí),CENP-F還可以通過(guò)結(jié)合Rb蛋白影響細(xì)胞增殖,在多種惡性腫瘤中也呈現(xiàn)高表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示,復(fù)發(fā)組患者Stathmin陽(yáng)性表達(dá)率、CENP-F陽(yáng)性表達(dá)率均高于未復(fù)發(fā)組,且相關(guān)分析結(jié)果顯示,Stathmin評(píng)分與CENP-F評(píng)分呈正相關(guān)(均P<0.05)。提示Stathmin與CENP-F之間可能存在調(diào)控機(jī)制,它們的陽(yáng)性表達(dá)情況或許是宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的影響因素。

為進(jìn)一步了解宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的影響因素,本研究對(duì)可能的影響因素進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示,切緣陽(yáng)性、HPV持續(xù)感染、HR-HPV種類(lèi)數(shù)≥2種、腺體受累、受累象限>3個(gè)、Stathmin陽(yáng)性表達(dá)及CENP-F陽(yáng)性表達(dá)均是宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。分析原因如下:(1)由于病灶范圍較難確定,宮頸LEEP后可能會(huì)存在一定的切緣陽(yáng)性,而切緣陽(yáng)性患者病變組織殘留較多,導(dǎo)致HR-HPV呈現(xiàn)持續(xù)感染狀態(tài),而術(shù)后HR-HPV持續(xù)感染可增加癌變的風(fēng)險(xiǎn),因而患者的復(fù)發(fā)率較高[14]。有研究顯示,HR-HPV種類(lèi)在SIL的篩查和診療中有重要作用,且種類(lèi)越多的患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)越高[15],多重HR-HPV感染可能是SIL患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素[16]。(2)宮頸管腺體內(nèi)一般會(huì)存在非典型增生,但其可能被正常的細(xì)胞遮擋而無(wú)法被LEEP有效清除,且其難以在常規(guī)的細(xì)胞學(xué)檢查和陰道鏡檢查中發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加,且容易發(fā)展成浸潤(rùn)癌[17]。(3)病變受累象限較多的患者完全切除難度較大,復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高。(4)Stathmin蛋白高表達(dá)時(shí),微管的生長(zhǎng)受到抑制,從而抑制微管多聚化,致使微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而解聚,這為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利環(huán)境。而CENP-F過(guò)表達(dá)能夠使細(xì)胞有絲分裂中著絲點(diǎn)聚集,導(dǎo)致染色體分離障礙,使得細(xì)胞染色體倍數(shù)異常,加之宮頸癌周?chē)h(huán)境已經(jīng)改變,在CENP-F影響下,腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加。有研究發(fā)現(xiàn),患者的年齡、月經(jīng)紊亂或絕經(jīng)、孕次、產(chǎn)次等也是宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的影響因素[18-19],與本研究結(jié)果不完全相符,原因可能是本研究的樣本量較小,相關(guān)結(jié)果還有待加大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

CENP-F主要分布于宮頸鱗狀上皮的副基底層和基底層,其表達(dá)水平隨SIL級(jí)別的增加而升高,且逐步向表層和中層蔓延,可作為預(yù)測(cè)宮頸HSIL預(yù)后的有效分子標(biāo)志物[20]。有研究顯示,抑制CENP-F的過(guò)表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn),抑制Stathmin過(guò)表達(dá)也可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移,延緩腫瘤的進(jìn)展[21]。本研究結(jié)果顯示,Stathmin評(píng)分、CENP-F評(píng)分預(yù)測(cè)宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的曲線(xiàn)下面積分別為0.843、 0.865,且當(dāng)Stathmin評(píng)分和CENP-F評(píng)分分別為2.01分和3.03分時(shí),其預(yù)測(cè)宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的靈敏度分別為73.28%和75.32%,特異度分別為62.49%和64.18%。提示Stathmin評(píng)分、CENP-F評(píng)分可用于評(píng)估宮頸LEEP后的預(yù)后。

綜上所述,與宮頸HSIL患者宮頸LEEP后未復(fù)發(fā)者相比,復(fù)發(fā)者Stathmin陽(yáng)性表達(dá)率、CENP-F陽(yáng)性表達(dá)率升高,Stathmin陽(yáng)性表達(dá)、CENP-F陽(yáng)性表達(dá)是宮頸HSIL患者宮頸LEEP后復(fù)發(fā)的影響因素,二者可作為評(píng)估宮頸HSIL患者宮頸LEEP后預(yù)后的指標(biāo)。