曹文潔, 許 毛, 余惠凡,3, 劉 麗, 錢永帥, 李 飛△

湖北醫(yī)藥學院1藥學院2武當特色中藥研究湖北省重點實驗室3生物醫(yī)藥研究院,十堰 442000

中性粒細胞是第1個被招募至機體病原感染和組織損傷部位的細胞效應器,在炎癥、免疫細胞募集、病原體清除和組織修復中發(fā)揮重要作用,主要通過吞噬、脫顆粒、生成細胞因子和中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成等4種機制執(zhí)行其功能[1]。近年來,大量研究表明NETs參與了腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)[2]、糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)[3]、狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)[4]等多種腎臟疾病的病理生理過程,本文通過綜述NETs在腎臟疾病中的最新研究進展,為腎臟疾病的診療提供新的思路。

1 NETs概述

作為一種纖維網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu),NETs在2004年首次被發(fā)現(xiàn)參與捕獲并殺滅病原體,在機體受到細菌、病毒等病原微生物刺激時由中性粒細胞活化后產(chǎn)生,主要以解聚的染色質(zhì)DNA為骨架和多種蛋白質(zhì)顆粒結(jié)合組成。蛋白顆粒主要包括組織蛋白酶G(cathepsin G,CG)、瓜氨酸化組蛋白(citrullinated histone H3,CitH3)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)及中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)等30多種活性蛋白[5]。CitH3是組蛋白H3中肽酰精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的產(chǎn)物,高度參與NETs的形成過程。NETs作為一種天然屏障,可有效捕獲并殺滅病原體,然而形成過多或清除異常會引發(fā)機體功能障礙,導致組織器官損傷和疾病的發(fā)生,如自身免疫性疾病、癌癥和血栓[6]。故NETs被認為是多種疾病的潛在致病因素。

2 NETs的形成機制

NETs的形成過程被稱為NETosis,是一種不同于凋亡和細胞壞死的特殊細胞死亡方式,也是一種全新的細胞免疫應答方式[7]。研究表明,細菌、LPS、干擾素、缺氧、血小板、自身抗體等均可刺激中性粒細胞產(chǎn)生NETs,激活中性粒細胞后,肽基精氨酸脫亞氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4,PAD4)通過誘導組蛋白瓜氨酸化,使其強正電荷降低從而弱化DNA和組蛋白的結(jié)合,緊接著核膜和顆粒膜消失,NE轉(zhuǎn)移至細胞核并作用于組蛋白使染色質(zhì)解聚,瓜氨酸化的組蛋白、解聚后的DNA及顆粒蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)合成NETs,最后被排出細胞外[5](圖1)。

圖1 NETs的生成Fig.1 NETs formation

NETs的形成機制分為兩種,經(jīng)典途徑依賴于NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS,細胞膜破裂后染色質(zhì)DNA及相關(guān)蛋白質(zhì)釋放至細胞外,導致中性粒細胞死亡[8];此外,有研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mitochondrial,mtDNA)釋放可導致80%的中性粒細胞在15 min內(nèi)通過識別補體因子5a或LPS形成NETs[9]。非經(jīng)典途徑是在中性粒細胞膜完整的情況下,染色質(zhì)以囊泡出芽的方式被排出細胞,細胞膜重新閉合,形成的無核中性粒細胞繼續(xù)行使其趨向性及吞噬作用等職能[10]。無ROS參與的NETs形成過程是一種NETosis的特殊途徑,其具體機制和生理意義還有待闡明。

3 NETs與急性腎損傷

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是腎臟疾病患者死亡的常見原因,病理表現(xiàn)通常包括腎小管受損、腎血管功能失調(diào)、過度炎癥和免疫細胞浸潤[11]。最新研究表明,NETs參與了腎臟缺血再灌注損傷、溶血性尿毒綜合癥(hemolytic uremic syndrome,HUS)和膿毒癥引起的AKI發(fā)病進程[2,12-13]。

3.1 腎缺血再灌注損傷

缺血再灌注(I/R)是AKI最常見的原因之一,可引發(fā)介導腎細胞壞死、凋亡、炎癥和纖維化的信號級聯(lián)反應[14]。腎缺血后大量腎小管上皮細胞壞死或凋亡,壞死細胞具有高度的免疫刺激性,它們會導致細胞中核成分的釋放,如DNA、組蛋白和促炎分子HMGB1溢出到細胞外,從而觸發(fā)炎癥,進一步加劇組織缺血和損傷。組蛋白瓜氨酸化及DNA外溢是NETs形成的關(guān)鍵步驟[15]。

研究發(fā)現(xiàn),IRI大鼠腎組織中MPO、CitH3表達顯著增加,血清SOD活性降低,且腎組織中Bax mRNA水平顯著升高,Bcl-2 mRNA水平降低,而脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonucleaseⅠ,DNaseⅠ)干預后NETs含量明顯降低,表明DNaseⅠ預處理可通過抑制細胞凋亡減輕腎臟IRI,提示NETs介導了腎I/R導致的組織損傷[2]。進一步研究發(fā)現(xiàn),小鼠腎臟IRI使緊鄰壞死細胞管型的血小板活化增加,血小板-粒細胞相互作用并形成NETs,而氯吡格雷可通過抑制血小板生成而減少細胞壞死和炎癥,且抑制了NETs生成[16]。另有研究發(fā)現(xiàn),腎I/R后,PAD4在浸潤的白細胞中高度表達,并伴隨著組蛋白H3的瓜氨酸化和小鼠腎臟中NETs的形成;而PAD4缺陷小鼠腎臟中未形成NETs,促炎因子表達較低,腎IR誘導的AKI損傷較輕;DNaseⅠ或PAD4特異性抑制劑YW3-56可改善野生型小鼠腎I/R誘導的AKI[15]。

在AKI期間,中性粒細胞首先浸潤腎間質(zhì),有研究發(fā)現(xiàn)補體C3敲除后小鼠I/R腎損傷減輕,且中性粒細胞浸潤和NETs生成減少,PAD4抑制劑GSK484也可減少NETs的釋放;在體外,C3a可誘導NETs形成,CitH3和MPO共定位于細胞外DNA結(jié)構(gòu)上[17]。以上結(jié)果表明,C3缺乏可通過減少中性粒細胞浸潤和NETs形成改善AKI,靶向C3激活可能是緩解AKI中NETs壞死性炎癥的治療新策略。

3.2 溶血性尿毒癥綜合征(HUS)

HUS主要由大腸埃希菌產(chǎn)生的志賀毒素(Stx)感染引起,是一種以微血管性溶血、血小板減少和急性腎衰竭為特征的血管疾病。研究表明,HUS患者血漿中循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)和核小體的含量與健康人相比更高,且HUS患者的中性粒細胞自發(fā)性NETosis能力更強;另外,Stx可在健康人中性粒細胞中誘發(fā)NETosis,在HUS期間,NETs可導致微血管系統(tǒng)炎癥反應發(fā)生和血栓形成,從而誘發(fā)腎功能衰竭[18]。最新研究發(fā)現(xiàn),Stx2a可通過NADPH氧化酶依賴性途徑以劑量依賴性方式誘導人中性粒細胞釋放NETs并產(chǎn)生ROS,且急性期HUS患者的中性粒細胞更容易通過此途徑發(fā)生自發(fā)性NETosis[19]。研究表明,LPS和Stx2處理血小板后,通過DNaseⅠ降解NETs或使用抗P-選擇素抗體阻礙中性粒細胞-血小板聚集體形成可減少NETs介導的內(nèi)皮細胞損傷;將LPS和Stx2注射到血小板耗盡的小鼠中,DNA-組蛋白和DNA-彈性蛋白酶復合物水平降低,全身內(nèi)皮損傷/功能障礙減少,表明減少中性粒細胞-血小板聚集體或NETs形成可緩解HUS誘導的內(nèi)皮損傷[20]。在血栓性微血管病患者中,50%的Stx相關(guān)HUS患者降解NETs的能力下降,且降解水平與血清肌酐含量呈負相關(guān),表明NETs降解能力不足對腎功能產(chǎn)生了一定負面影響[12]。由此可知,NETs與HUS疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

3.3 膿毒癥AKI

膿毒癥是由宿主對感染反應失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙,是一種特殊類型的AKI,可引起腎血流動力學紊亂及腎灌注不足,導致炎癥等惡性循環(huán)[21]。NETs的形成在膿毒癥AKI中起關(guān)鍵作用,抑制膿毒癥模型小鼠NETs形成可下調(diào)其腎組織炎癥因子、降低肌酐及尿素氮水平,明顯改善膿毒癥導致的腎功能障礙[13]。AKI期間組織損傷釋放的組蛋白會加重腎功能衰竭,而在體外,細胞外組蛋白與TLR2和TLR4相互作用,誘導MyD88、NF-κB和MAPK信號傳導,對腎內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞有直接的毒性作用;將組蛋白直接注射到小鼠的腎動脈后,組蛋白也以TLR2/TLR4依賴性方式誘導白細胞募集、微血管滲漏、腎臟炎癥,而抗組蛋白IgG可中和組蛋白的免疫刺激作用,抑制腎內(nèi)炎癥、中性粒細胞浸潤和腎小管細胞壞死,并改善腎排泄功能障礙[22]。另有研究發(fā)現(xiàn),通過小分子TAK-242或抗TLR4 IgG抑制TLR4可減少中性粒細胞NETs形成和ROS產(chǎn)生[23],為抑制NETs形成改善腎損傷提供了新的治療策略。

3.4 COVID-19相關(guān)AKI

AKI已成為COVID-19常見的后遺癥,CoV-2-AKI可能表現(xiàn)為塌陷性腎小球病、急性間質(zhì)性腎炎或急性腎小管損傷[24]。體外研究表明SARS-CoV-2可激活人中性粒細胞NETosis并促進ROS生成[25]。活化的血小板表達P-選擇素,導致血小板-中性粒細胞相互作用、中性粒細胞活化及NETs的釋放,從而誘導COVID-19中的血栓炎癥,進而導致終末器官損傷[26]。

4 NETs與慢性腎臟疾病

慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)以腎小球濾過率下降為主要特征,包括蛋白尿、高血壓、水腫等多種臨床癥狀,最終發(fā)展為終末期腎病[27]。NETs作為炎癥發(fā)生過程中的重要組分,介導了多種類型CKD,如糖尿病腎病。

4.1 糖尿病腎病

DKD是糖尿病患者微血管發(fā)生的嚴重并發(fā)癥之一,也是終末期腎臟病最常見的病因之一,臨床上以腎小球基底膜增厚、細胞外基質(zhì)形成增多、腎小管間質(zhì)纖維化為主要特征,最終導致尿蛋白增加和估算腎小球濾過率(eGFR)降低[28],

研究表明,鏈脲佐菌素誘導的DKD小鼠模型及DKD患者腎臟組織中MPO及CitH3沉積明顯增多,且腎小管區(qū)域E-cadherin表達明顯下調(diào)、α-SMA表達明顯上調(diào);用高糖誘導的NETs干預人腎小管上皮細胞后,發(fā)現(xiàn)E-cadherin、α-SMA、Snail等上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白向相反趨勢變化,表明NETs可能通過介導腎小管EMT進程參與了糖尿病腎臟纖維化[29]。對糖尿病患者進行隨訪發(fā)現(xiàn),NETs的主要成分雙鏈脫氧核糖核酸(double strain deoxyribonucleic acid,dsDNA)濃度每增加1個標準差,發(fā)展為DKD的風險增加2.4倍;在T1DM與T2DM小鼠模型中,DNaseⅠ干預可顯著抑制小鼠UACR水平的增高,減少腎臟糖原沉積,減輕足細胞及內(nèi)皮細胞損傷;使用NETs干預腎小球血管內(nèi)皮細胞后,內(nèi)皮細胞的標志蛋白表達下調(diào),同時白蛋白透過率增加,表明循環(huán)中dsDNA水平與DKD相關(guān),且dsDNA可在一定程度上預測DKD進展[3]。

T1DM是胰腺β細胞發(fā)生特異性自身免疫性破壞,導致胰島素絕對缺乏而引起營養(yǎng)物質(zhì)代謝性異常疾病。在T1DM小鼠模型中,胰島中中性粒細胞和NETs含量豐富,抑制中性粒細胞功能可減緩T1DM發(fā)展[30]。新生NOD小鼠的胰腺中中性粒細胞浸潤并伴隨著NE短暫升高,NE抑制劑可減弱NOD小鼠炎性巨噬細胞浸潤,并通過抑制胰島炎癥顯著降低T1DM發(fā)病率[31]。這些觀察結(jié)果表明中性粒細胞和NETs在T1DM發(fā)病機制中起作用,調(diào)節(jié)NETs生成和中性粒細胞功能在治療T1DM中具有重要意義。另有研究發(fā)現(xiàn),T2DM患者蛋白尿異常時NETs水平較高,其主要成分MPO、NE與UACR、BUN水平呈正相關(guān),NE與eGFR水平呈負相關(guān),表明MPO和NE為UACR主要影響因素,可能通過促進腎臟炎癥反應及纖維化等病理途徑參與DKD的發(fā)生發(fā)展,有利于DKD早期診斷和病情監(jiān)控,可作為未來診斷和評估DKD嚴重程度的潛在生物標記物[32]。除了在糖尿病發(fā)展中的潛在作用外,NETs生成增多還可導致糖尿病患者傷口遷延不愈。據(jù)報道,與正常小鼠相比,糖尿病小鼠的傷口中CitH3表達較高且愈合速度較慢,而DNaseⅠ治療可加速傷口愈合[33]。二甲雙胍是T2DM患者的一線降糖藥物,治療2個月后可降低患者血清中NETs相關(guān)成分MPO、CitH3的水平[34]。

4.2 雙酚A所致慢性腎病

研究發(fā)現(xiàn),長期低劑量雙酚A(bisphenol-A,BPA)暴露會引起小鼠慢性腎臟損傷、腎功能下降,腎組織出現(xiàn)形態(tài)學變化,且該過程伴隨NETs相關(guān)標志蛋白在腎小球的沉積。利用DNaseⅠ降解NETs可有效緩解BPA誘導的慢性腎臟損傷,腎功能有所恢復。通過體外實驗表明DNase Ⅰ降解NETs后可有效緩解BPA誘導的足細胞損傷。以上證實了NETs參與BPA所導致的慢性腎損傷,對CKD的防治具有重要臨床價值[35]。

5 NETs與自身免疫性腎病

含有DNA和抗dsDNA IgG抗體的免疫復合物沉積于腎臟并導致腎炎,組蛋白、dsDNA和中性粒細胞顆粒蛋白等多種NETs成分被認為是系統(tǒng)性自身免疫性疾病中自身抗原的重要來源[36]。當自身抗體效應機制未能及時消除NETs相關(guān)抗原時,就會發(fā)生炎癥性組織損傷和細胞內(nèi)抗原的釋放,免疫介導損傷后組織修復機制的激活又可導致纖維化,并最終導致腎衰竭[37]。

5.1 狼瘡性腎炎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種多器官自身免疫性疾病,LN為SLE累及腎臟導致的繼發(fā)性免疫性腎小球疾病。SLE患者具有獨特的中性粒細胞亞群,稱為低密度粒細胞(low-density granulocytes,LDGs),可刺激漿細胞樣樹突細胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)產(chǎn)生Ⅰ型IFN-α[38]。研究表明,SLE患者外周血單核細胞中的LDGs可自發(fā)形成NETs[39]。如果NETs不能被DNaseⅠ完全降解,則會與其他蛋白質(zhì)形成復合物長時間存在,導致抗原刺激延長并沉積在腎小球基底膜上,從而誘發(fā)腎炎[40]。另有研究發(fā)現(xiàn),中性粒細胞過度釋放NETs和DNaseⅠ不完全清除是LN患者血漿中cfDNA水平升高的主要原因,導致蛋白尿、白蛋白水平下降和肌酐清除率降低[41]。DNaseⅠ缺陷可導致自身抗體產(chǎn)生,增加小鼠患SLE的風險,發(fā)生更嚴重的腎損傷[42]。NETs通過B細胞受體和TLR9激活B細胞,產(chǎn)生抗DNA和LL-37的自身抗體,而自身抗體與NETs中DNA和LL-37結(jié)合的抗DNA復合物可被pDC和B細胞識別,從而使自身免疫性炎癥持續(xù)存在,形成有害的自身免疫循環(huán)[43]。

NETs的凋亡或壞死物質(zhì)是自身抗原的主要來源,負責促進自身免疫和加劇組織損傷,自身抗體通過阻止其降解和促進激活補體使NETs持續(xù)存在[44],因此NETs成分和針對它們的自身抗體與SLE密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)MRL/lpr狼瘡小鼠中NETs形成較快,且可產(chǎn)生針對NETs的自身抗體,并常伴有內(nèi)皮功能障礙,PAD抑制劑可顯著改善內(nèi)皮功能,同時下調(diào)IFN下游基因的表達,還可減少蛋白尿和免疫復合物沉積[45]。虎杖甙處理也可在體內(nèi)外顯著抑制ROS介導的NETs形成,降低MRL/lpr小鼠蛋白尿、自身循環(huán)抗體水平和免疫復合物在腎臟中的沉積[46]。

活動性SLE中性粒細胞釋放的NETs富含組織因子和IL-17A,在腎臟等多個靶器官中促進血栓形成、炎癥、組織損傷和纖維化。在狼瘡腎炎患者中,可觀察到由腎小球內(nèi)的組織因子和靠近腎小球囊的小管間質(zhì)室形成的NETs,表明NETs可能參與包膜破裂和新月體形成[47]。研究表明,LN樣本中mtDNA和MPO共定位于中性粒細胞浸潤區(qū)域,且抗mtDNA自身抗體、蛋白尿量與LN活動指數(shù)有較強相關(guān)性;二甲雙胍預處理可呈濃度依賴性抑制NETs的形成,并減少由mtDNA刺激的漿細胞樣樹突狀細胞中IFN-α的分泌,與單獨使用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)治療的中性粒細胞相比,二甲雙胍在PMA刺激40 min后使NETs中的mtDNA拷貝數(shù)減少了57%[48]。以上結(jié)果表明NETs參與了LN的發(fā)病機制,可作為LN或其他自身免疫性疾病的治療靶點,為治療LN提供了新的切入點。

5.2 抗中性粒細胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎

抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關(guān)性血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies associated vasculitis,AAV)是一種以血管炎癥、內(nèi)皮損傷和組織損傷為特征的自身免疫性疾病,主要累及腎臟、肺、皮膚和周圍神經(jīng),研究表明中性粒細胞與ANCA-IgG共同孵育可誘導NETs生成,且AAV血清中DNA-MPO復合物水平較高[49]。MPO和組蛋白對人上皮細胞和內(nèi)皮細胞具有直接的細胞毒性作用,細胞外MPO可誘導AAV患者腎小球和間質(zhì)損傷[50]。此外,對AAV患者的腎活檢標本進行免疫染色顯示,在炎癥區(qū)域、伴有壞死性腎小球腎炎的腎臟纖維蛋白樣壞死區(qū)域周圍以及小葉間動脈壁存在CitH3、MPO和PAD4,表明NETs的形成與AAV中的血管損傷和免疫系統(tǒng)激活有關(guān)[51]。

6 NETs與其他腎臟疾病

6.1 腎癌

腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤之一,約占成人惡性腫瘤的3%。NETs釋放的DNA成分可成為癌細胞的趨化因子,而不僅僅是癌細胞的“誘捕網(wǎng)”。NETs作為中性粒細胞發(fā)揮免疫作用的重要途徑之一,可在腎癌患者的外周血中檢出,循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)計數(shù)與NETs產(chǎn)生的關(guān)鍵分子如MPO、ELANE、MMP-9、PAD4、CTSG、HMGB2等的表達呈正相關(guān),NETs形成的DNA骨架與纖維蛋白網(wǎng)能夠捕獲腎癌CTC,以協(xié)助其逃過免疫系統(tǒng)的攻擊并存活[52]。研究表明,荷瘤小鼠表現(xiàn)出腎損傷的臨床特征,通過使用DNaseⅠ或PAD4抑制劑對胰島素瘤RIP1-Tag2小鼠或乳腺癌MMTV-PyMT小鼠進行全身治療,可去除NETs,緩解腎損傷,使心臟和腎臟血管灌注恢復到健康小鼠的水平[53]。以上結(jié)果表明NETs與腎癌發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。

6.2 腎移植排斥

急性抗體介導的排斥反應(acute antibody-mediated rejection,AAMR)是器官移植失敗的主要原因之一[54],其關(guān)鍵臨床特征是微血管炎癥,具體表現(xiàn)為內(nèi)皮損傷及毛細血管內(nèi)存在以激活中性粒細胞為主的免疫細胞[55-56]。研究表明,腎移植患者血漿中NETs數(shù)量較多,且AAMR的組織樣本中網(wǎng)狀中性粒細胞豐富;與供體相比,所有腎移植患者的自發(fā)性NETosis均增強[57],表明NETs可能為腎移植排斥反應的發(fā)病機制之一。

7 小結(jié)

本文總結(jié)了NETs在急性腎損傷、慢性腎病、狼瘡性腎炎等多種腎病發(fā)生發(fā)展中的作用。近年來國內(nèi)外的研究表明,NETs除了能殺滅病原微生物外,還從多方面參與并影響了腎臟疾病的病理生理過程,其關(guān)鍵成分MPO、CitH3、NE對疾病的發(fā)生發(fā)展都起著關(guān)鍵作用。雖然NETs在這些腎臟疾病中的具體作用機制及治療干預手段的研究尚處于起步階段,但已有的研究結(jié)果表明,DNaseⅠ或PAD4抑制劑可有效緩解多種腎臟疾病所致組織損傷;MPO抑制劑,如4-氨基苯甲酸酰肼或PF-1355,可減少NETs生成、中性粒細胞募集和循環(huán)細胞因子水平[58-59]。使用此類抑制劑可能會改善免疫復合物介導疾病患者的預后,例如SLE、血管炎和各種類型的腎小球腎炎。進一步明確NETs在腎臟疾病中的作用及其相關(guān)分子機制,如中性粒細胞和NETs與其他細胞類型(如血小板和內(nèi)皮細胞)之間的關(guān)聯(lián),將會為今后腎臟疾病的治療和特異性靶點藥物的開發(fā)提供新的發(fā)展思路。但由于NETs結(jié)構(gòu)的特殊性,目前其濃度檢測尚未用于臨床,NETs的體內(nèi)定量研究尚處于初級階段。今后,需進一步完善、精確化NETs檢測,實現(xiàn)腎病臨床預后的早期識別。本課題組也在深入研究NETs在腎纖維化進程中的作用,以期為腎纖維化治療提供新的靶點。