康文武, 唐 倩, 嚴江天, 蘇振宏, 梁鳳霞△

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430061 2腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室,黃石 435003

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是一項全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn),DN通常由2型糖尿病發(fā)展而來,是慢性腎病和終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的重要病因[1]。DN典型表現(xiàn)為持續(xù)的高蛋白尿和腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)下降[2]。糖尿病時高血糖、血流動力改變等因素持續(xù)損害著腎小球濾過屏障(glomerular filtration barrier,GFB),而GFB的改變直接導(dǎo)致了蛋白尿的發(fā)生發(fā)展。高蛋白尿是腎小球病變的標志,足細胞又是GFB的關(guān)鍵組成部分,所以足細胞損傷是DN發(fā)展的核心機制[3]。因此,本文闡述了DN中足細胞損傷模式并分析其多種損傷機制,旨在為后續(xù)的研究提供思路和方向。

1 足細胞及其在DN中的損傷模式

足細胞是一種終末分化的、高度特化的腎小球臟層上皮細胞,它附著在腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)表面,與腎小球內(nèi)皮細胞和腎小球基膜一同構(gòu)成腎小球濾過屏障。足細胞呈星狀,其多個胞體伸長,這種結(jié)構(gòu)稱為足突(foot processes,FPs);鄰近足細胞的足突相互穿插交錯,交錯形成的裂隙由一段拉鏈狀的裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)連接。與SD組成密切相關(guān)的Nephrin、NEPH1、FAT、Podocin和Ephrin B1等蛋白可跨膜在FPs內(nèi)進行信號分子傳遞。FPs內(nèi)含有密集的細胞骨架網(wǎng)絡(luò),其中肌動蛋白絲不僅與SD連接,還與GBM上的錨蛋白如α3β1整合素(α3β1 integrin)、肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖等連接。因此,足突與足突之間、足細胞與基底膜之間形成結(jié)構(gòu)獨立又高度依賴的存在模式,這種模式對于維持足細胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及相互之間的信息交流至關(guān)重要。足細胞通過釋放血管內(nèi)皮生長因子A來調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細胞的生長、存活、分化及其通透性。

隨著DN的發(fā)生發(fā)展,腎小球及足細胞的結(jié)構(gòu)、功能均發(fā)生改變。糖尿病會誘導(dǎo)腎小球出現(xiàn)適應(yīng)性的病理變化:GBM增厚、系膜細胞肥大和增殖、系膜基質(zhì)沉淀等。同時,足細胞會發(fā)生骨架重排、足突融合甚至消失,細胞間緊密連接形成增加,狹縫隔膜長度減少,甚至足細胞減少[4]。這些細胞功能障礙會導(dǎo)致腎小球內(nèi)毛細血管通透性的變化和GFB的損傷,并最終導(dǎo)致蛋白尿[5]。因此足細胞損傷是DN及其進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。足細胞損傷引起的腎小球病變也是局灶階段性腎小球硬化、微小病變性腎病、狼瘡性腎炎和膜性腎病等疾病的主要病理特征[6-7](圖1)。

圖1 足細胞損傷的主要病理特征Fig.1 Pathological features of podocyte injury

2 DN狀態(tài)下足細胞損傷機制

2.1 糖毒性

高血糖是DN發(fā)生發(fā)展最直接、最主要的危險因素之一。機體在高葡萄糖環(huán)境中發(fā)生胰島素抵抗導(dǎo)致葡萄糖代謝異常,部分葡萄糖不依賴胰島素即可進入細胞,它激活了細胞內(nèi)的糖代謝旁路途徑,如多元醇(polyol)途徑和己糖胺途徑,這導(dǎo)致山梨醇和二酰基甘油等有毒中間代謝產(chǎn)物的積累[8],而過多的山梨醇氧化成果糖[葡萄糖被醛糖還原酶還原后轉(zhuǎn)化為山梨醇,山梨醇在山梨醇脫氫酶的作用下又氧化生成果糖,其過程均依賴于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)],引起還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD)的值升高,產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)水平升高。此外,果糖可促進晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)生成,大量的AGEs與其受體RAGE結(jié)合通過激活不同的細胞內(nèi)信號通路,例如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)和核因子kappa-B(NF-κB)來誘導(dǎo)OS以及炎癥級聯(lián)反應(yīng)等,這些病理進程會導(dǎo)致大部分腎臟細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙?？傊?過量的葡萄糖內(nèi)流激活細胞信號通路,其中包括二?；视?蛋白激酶C(DAG/PKC)通路、AGEs途徑、多元醇通路和己糖胺通路。這些因素相互作用,從而加重炎癥過程,促進了糖尿病狀態(tài)下腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展[9]。

當使用醛糖還原酶抑制劑后,明顯減輕了DN小鼠基底膜增厚、系膜基質(zhì)沉淀和足突融合等病理損傷,并提高了足細胞相關(guān)蛋白Nephrin和Podocin表達[10]。有趣的是,Qi等[8]回顧某項大型隊列研究,對病程超過50年的1型糖尿病患者按有無DN并發(fā)癥進行分組,取腎活檢組織標本進行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測并進行比較分析后得出結(jié)論,沒有DN并發(fā)癥的糖尿病患者中存在更高水平的葡萄糖代謝酶,這些代謝酶與糖酵解通量增加密切相關(guān),是糖尿病患者腎小球免受高糖毒性損害的主要因素。研究者們?yōu)榱俗C明這個結(jié)論,不管是在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的腎皮質(zhì),還是體外暴露于高糖環(huán)境的足細胞,測得的PKM2或PKM1的蛋白質(zhì)水平均沒有明顯變化。然而,在體內(nèi)實驗中,PKM2激動劑的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了DN小鼠模型中糖代謝異常和線粒體功能障礙;在體外實驗中,PKM2敲低的足細胞不管是處在高糖環(huán)境還是低糖環(huán)境都出現(xiàn)了明顯的DNA斷裂[8,11]?？梢?在DN高血糖的情況下,除了減少葡萄糖的攝入,在一定程度上增加葡萄糖代謝通量以減少糖毒性損傷是值得進一步探索的DN治療策略。

2.2 脂毒性

越來越多的證據(jù)表明,脂質(zhì)代謝異常是DN發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。過度的脂質(zhì)積累導(dǎo)致的腎臟細胞損傷被稱為腎脂毒性。臨床試驗與動物實驗均顯示,DN模型血漿中含有高濃度的膽固醇[12]、游離脂肪酸、甘油三酯等[13-14]。足細胞對脂質(zhì)變化高度敏感,足細胞中脂質(zhì)過度積累可導(dǎo)致線粒體OS、肌動蛋白細胞骨架重塑、胰島素抵抗、自噬損傷以及炎癥反應(yīng),最終可導(dǎo)致足細胞肥大、脫離和死亡[7]。

足細胞脂質(zhì)的積累歸因于脂肪的生成增加和分解減少。與脂肪生成相關(guān)的一些基因是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBP)和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ),而PPARα則起誘導(dǎo)脂肪分解的作用[15]。游離脂肪酸過量時,會經(jīng)由膜蛋白CD36被運送到細胞內(nèi)而后合成大量的甘油三酯,與多余的膽固醇一同積聚在脂滴中,這種過量的脂通量對一些重要的細胞器(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等)的形態(tài)和功能造成直接的損傷,引起線粒體OS、溶酶體損傷以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,最終導(dǎo)致細胞凋亡[15],這對于能量消耗大的足細胞來說無疑是致命的損傷。AdipoRon是一種脂聯(lián)素受體激動劑,脂聯(lián)素通過誘導(dǎo)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化和PPARα表達來介導(dǎo)脂肪酸代謝。在給予AdipoRon處理后的db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中觀察到p-AMPK(Thr172)和PPARα等蛋白上調(diào),以及SREBP-1c和iNOS等蛋白水平下調(diào),證明了AdipoRon可以通過改善脂質(zhì)代謝來預(yù)防DN[16]。同樣,在高糖暴露下的人類腎小球內(nèi)皮細胞和小鼠足細胞中,AdipoRon被證實可通過激活細胞內(nèi)CaMKKβ/p-LKB1(Ser431)/p-AMPK(Thr172)/PPARα通路和下游信號傳導(dǎo),減少高糖誘導(dǎo)的OS和細胞凋亡,改善細胞功能[17]。G蛋白偶聯(lián)受體43(GPR43)是參與膽固醇代謝的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,GPR43基因敲除后的糖尿病小鼠腎臟中膽固醇明顯減少。與體內(nèi)實驗類似,在體外用GPR43 siRNA處理高糖高脂模型足細胞后發(fā)現(xiàn),GPR43可通過調(diào)節(jié)早期生長反應(yīng)蛋白1(EGR1)途徑上調(diào)低密度脂蛋白受體(LDLR)對膽固醇的攝取以及抑制自噬介導(dǎo)的膽固醇降解,促進足細胞損傷[12]?？梢?脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)對于足細胞功能完整性至關(guān)重要。

2.3 氧化應(yīng)激

OS一直被認為是DN發(fā)展的主要機制之一,與糖脂代謝失衡和血流動力學(xué)改變密切相關(guān)[18]。OS是導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的破壞的重要因素之一,腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞、足細胞和腎小管上皮細胞在內(nèi)的多種腎細胞的損傷都與OS相關(guān)[19]。在DN中,AGEs的積累刺激ROS的產(chǎn)生,當抗氧化物水平不足以消耗ROS時,多余的ROS則容易引起DNA損傷,從而激活p53及其下游途徑以誘導(dǎo)細胞凋亡。線粒體是ROS生成的主要場所,線粒體中的DNA損傷導(dǎo)致線粒體功能障礙,導(dǎo)致足細胞足突融合、凋亡且脫落以及足細胞相關(guān)蛋白的減少[20]。

沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirtuin1,SIRT1)和AMPK是維持細胞和全身能量穩(wěn)態(tài)的重要營養(yǎng)感受器,通常在營養(yǎng)過剩時沉默,在營養(yǎng)消耗的情況下被激活。AMPK與SIRT1二者具有協(xié)同作用,共同發(fā)揮抗氧化特性,在保護線粒體功能中起著重要的作用。體外實驗顯示,在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的足細胞p-AMPK/AMPK比值明顯降低,線粒體發(fā)生腫脹、裂變等變化,線粒體功能明顯降低[21]。白藜蘆醇(一種SIRT1激活劑)可通過激活SIRT1/PGC-1α途徑介導(dǎo)線粒體保護作用,降低高糖刺激誘導(dǎo)的足細胞氧化損傷和凋亡[22]。葡萄籽原花青素B2作為一種強抗氧化劑,在體外研究中被證實可通過激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α途徑降低足細胞中ROS水平和減輕線粒體損傷[23]?？梢?通過激活抗氧化途徑來降低ROS水平、保護線粒體功能是保護DN中足細胞免受OS損傷的必要途徑之一。

2.4 炎癥

在DN病理條件下,長期的OS和糖脂代謝中間產(chǎn)物的積累可誘發(fā)過度的炎癥反應(yīng),慢性炎癥已被公認為是DN向ESRD發(fā)展的促進因素[24]。在高糖環(huán)境下,內(nèi)皮細胞釋放白細胞粘附分子和趨化因子,包括血管細胞粘附分子-1、細胞間粘附分子-1和單核細胞趨化蛋白1等[20],募集單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞浸潤腎組織并促進炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、TGF-β和NF-κB)的產(chǎn)生,這些因子在促進糖尿病腎損傷中起關(guān)鍵作用[25-26]。在DN患者的腎組織活檢中觀察到,巨噬細胞在趨化因子上調(diào)時浸潤腎組織,并證實巨噬細胞在腎臟中的積累是慢性腎臟疾病進展的突出特征,與腎小球濾過率下降和預(yù)后不良密切相關(guān)[27]。

從機制上來說,JAK2/STAT3/SOCS1信號通路、AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路、TGF-β/Smad信號通路和MAPK/NF-κB信號通路是典型的炎癥信號通路,炎癥相關(guān)信號通路被激活時各通路之間往往發(fā)生串擾反應(yīng),在介導(dǎo)糖尿病腎損傷中起關(guān)鍵的作用。多項研究表明,當上述炎癥信號通路被抑制時,DN模型中的炎癥因子水平明顯下調(diào),足細胞相關(guān)蛋白Podocin和Nephrin顯著上調(diào),腎小球病理變化明顯改善[25,28-32]。

2.5 自噬

眾所周知,自噬對腎臟中所有主要細胞(包括足細胞、系膜細胞和內(nèi)皮細胞)的細胞穩(wěn)態(tài)具有顯著影響。自噬的主要作用是降解蛋白質(zhì)、去除受損的細胞器以及調(diào)節(jié)糖脂代謝平衡。在自噬過程中,p62與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合,再與自噬小體膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成復(fù)合物,一同在自噬溶酶體內(nèi)被降解。足細胞是高度分化的細胞,沒有分裂能力,因此細胞內(nèi)的自噬降解系統(tǒng)對于維持足細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在DN的早期,腎臟暴露于高糖、炎癥和OS等刺激下,出于自我保護可出現(xiàn)自噬水平上調(diào),但后期由于溶酶體損傷導(dǎo)致自噬過程受到抑制,自噬受損導(dǎo)致腎臟細胞損傷,出現(xiàn)GBM增厚、系膜擴張、足細胞丟失和大量蛋白尿[33]。有研究發(fā)現(xiàn),50周齡的OLETF大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿伴有足細胞丟失,在其足細胞中觀察到有大量受損的溶酶體,并檢測到p62蛋白水平升高,這些特征均提示自噬水平不足[34]。

在雷帕霉素(mTOR)成員中,雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通過調(diào)節(jié)ULK1磷酸化抑制自噬途徑,抑制細胞分解代謝。白藜蘆醇可以顯著降低STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎臟組織的p-mTOR/mTOR水平,并上調(diào)p-ULK1/ULK1以及自噬相關(guān)蛋白(Bclin1,LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)水平,通過改善脂質(zhì)代謝紊亂、抑制細胞凋亡和激活自噬來阻止足細胞進一步損傷[35-36]。mTOR上游的兩大營養(yǎng)素感受信號AMPK和SIRT1在DN中受到抑制。AMPK和SIRT1是自噬的正向調(diào)節(jié)因子,一旦被激活,SIRT1可通過去乙?；允上嚓P(guān)蛋白來促進自噬。此外,SIRT1可以與AMPK和mTOR通路串擾,調(diào)節(jié)能量代謝和促進自噬,減少細胞凋亡[37]。由此可見,在糖尿病條件下,自噬在維持足細胞穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。

2.6 表觀遺傳

越來越多的證據(jù)表明,與DN的病理改變相關(guān)的基因不僅受到經(jīng)典信號通路的調(diào)控,而且還受到表觀遺傳機制的調(diào)控[38]。表觀遺傳機制是指在不改變基礎(chǔ)DNA序列的情況下,與DN相關(guān)的基因和表型對長期不利刺激因素存在的環(huán)境作出相應(yīng)改變,且這種改變具有遺傳性。其主要涉及到染色質(zhì)組蛋白修飾、DNA甲基化和非編碼RNA方面。這也可以解釋為什么對DN進行血糖控制后,癥狀仍然會持續(xù)存在,這種現(xiàn)象被稱之為代謝記憶[38-39]。表觀遺傳學(xué)在與DN發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的病理生理過程的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用,包括腎小球病變、腎纖維化、慢性炎癥和其他病理特征[40]。

SIRT6是Ⅲ類NAD依賴性組蛋白去乙酰化酶,有研究發(fā)現(xiàn),SIRT6特異性缺失加劇了DN患者足細胞缺失和蛋白尿癥狀,并通過體內(nèi)外實驗證實SIRT6是通過降低Notch1和Notch4啟動子區(qū)域中的組蛋白H3K9乙?；?從而降低了足細胞中的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡,改善了肌動蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂,上調(diào)了Nephrin和Podocin水平,同時也恢復(fù)了足細胞自噬相關(guān)蛋白水平[41]。在足細胞中,轉(zhuǎn)錄因子Sp1與NF-κB p65相互作用,Sp1/NF-κB p65復(fù)合體直接參與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1,Dnmt1)調(diào)控。一項實驗證明,在使用DNA甲基化抑制劑治療db/db小鼠后,蛋白尿明顯減少,腎小球肥厚、系膜基質(zhì)擴張和足細胞損傷得到了明顯改善。另外高糖誘導(dǎo)下的足細胞中Dnmt1、Sp1和NF-kBp65的表達明顯增加,而在Dnmt1特異性敲除后又抑制了足細胞SD蛋白的減少[42]。同樣的,非編碼RNA的表達失調(diào)也與DN的發(fā)展密切相關(guān)。miR-192是第1個被報道與DN相關(guān)的特異性miRNA[43],miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-126-3p、miR-192-5p、miR-214-3p和miR-342-3p也在隨后的研究中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)與DN的損傷機制密切相關(guān)[40]。值得注意的是,miRNA既受DNA甲基化和組蛋白修飾的調(diào)節(jié),部分miRNA又可對DNMTs和組蛋白脫乙酰酶的水平進行調(diào)節(jié),這些基于遺傳學(xué)的證據(jù)對于闡釋DN的發(fā)病機制至關(guān)重要(圖2)。

3 結(jié)語

DN發(fā)展的病理機制十分復(fù)雜,涉及遺傳因素、表觀遺傳因素和環(huán)境之間的相互作用。盡管足細胞損傷在腎小球疾病中的地位已被證實,但是目前靶向足細胞損傷的治療方法仍然十分缺乏。足細胞和足細胞相關(guān)分子有可能作為生物標志物用于糖尿病腎損傷的早期診斷。所以,充分了解足細胞損傷的機制,找到參與足細胞損傷的重要基因分子和通路。對于后續(xù)探索靶向足細胞的治療方法至關(guān)重要。

圖2 足細胞的損傷機制Fig.2 Mechanism of podocyte injury