易 璇, 陳 麗, 王靜芝, 王雅媛, 鄭紫桐, 梁鳳霞

湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430065

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是一種由于內(nèi)分泌系統(tǒng)異常而導(dǎo)致的復(fù)雜病理狀態(tài)。它是糖尿病、冠心病、多囊卵巢綜合征等多種疾病的共同危險因素[1-2],嚴(yán)重威脅著人類的健康。IR不僅存在于骨骼肌、脂肪、腎臟等組織器官中,也存在于肝臟組織中[3]。研究表明,肝臟脂肪含量與胰島素敏感性密切相關(guān),降低肝臟脂肪含量能夠提高機體胰島素敏感性,改善IR[4]。又因為自噬是脂肪降解和儲存的重要環(huán)節(jié)[5],研究肝臟組織的自噬途徑成為改善肝臟胰島素敏感性的突破口。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 2 related enzyme 1,SIRT1)是一種誘導(dǎo)自噬的乙酰化酶,其可以通過去乙?；允上嚓P(guān)蛋白7(autophagy-related protein 7,ATG7)形成復(fù)合體,從而激活自噬。肝臟SIRT1表達降低,導(dǎo)致ATG7乙?；缴?可引起自噬流受損、肝臟脂質(zhì)沉積和血糖穩(wěn)態(tài)失衡[6-7]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)低頻電針可以減輕外周和中樞炎癥狀態(tài),調(diào)控能量代謝,改善IR,這種作用與SIRT1對其底物的去乙?；{(diào)控有關(guān)[8-9]。但是中樞SIRT1抑制劑并不能完全阻斷針刺效應(yīng),電針治療還可能通過其他途徑影響IR。本文在前期研究基礎(chǔ)上,觀察電針對肝臟組織SIRT1/ATG7信號通路的影響,探討電針治療IR的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只7周齡Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量(220±20)g,來源于湖北省實驗動物研究中心,許可證號:SCXK(鄂)2020-0018。飼養(yǎng)條件:湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房,溫度(25±2)℃,相對濕度(50±5)%,大鼠自由進食與飲水,12 h/12 h明暗周期。本實驗操作嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

0.30×13 mm一次性無菌針灸針、HANS LH202H型電針治療儀(北京華運安特科技有限責(zé)任公司),冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),電泳儀(北京六一儀器廠),酶標(biāo)儀(Diatek公司)、掃描儀(Canon公司)。

β-actin抗體(天德悅),SIRT1一抗、ATG7一抗(Abcam)、p-GSK-3β一抗(CST)、HRP-Goat anti Rabbit二抗(ASPEN)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、磷酸化蛋白酶抑制劑(ASPEN)、Protein A+G Agarose(碧云天)。

1.3 模型制備及評價

實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機選取10只以普通飼料喂養(yǎng),8周后隨機選取其中8只作為正常組,剩余50只以高脂飼料喂養(yǎng),制備IR大鼠模型。喂養(yǎng)8周后,測量大鼠體質(zhì)量,從高于正常組體質(zhì)量平均值20%的40只大鼠中隨機取3只行高胰島素-正葡萄糖鉗夾術(shù)(hyperinsulinemic-euglycemic clamp,HEC)以確定IR模型是否復(fù)制成功。若所測大鼠的葡萄糖輸注率(glucose infusion rate,GIR)小于正常組20%則認定為IR。將造模成功的40只大鼠隨機進行編號,并挑選32只隨機分入模型組、電針組、SIRT1激活劑組和SIRT1抑制劑+電針組,每組8只。

1.4 干預(yù)方法

電針組參照《實驗針灸學(xué)》[10]選取中脘、關(guān)元、足三里及豐隆四穴進行電針干預(yù)。足三里和豐隆連接同一組導(dǎo)線,關(guān)元和中脘連接另一組導(dǎo)線。電針刺激采用連續(xù)波,頻率2 Hz,強度1 mA。每次10 min,隔日1次,每周干預(yù)3次,共干預(yù)8周。SIRT1激活劑組給予SIRT1激活劑白藜蘆醇(200 mg/kg)灌胃給藥,每周3次,共8周。SIRT1抑制劑+電針組給予SIRT1特異性抑制劑EX527(10 mg/kg)腹腔注射給藥,每周3次,共8周,并于注射后實施與電針組相同的治療。

1.5 標(biāo)本采集

干預(yù)結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水12 h,采用2%戊巴比妥鈉(0.25 mL/100 g)行腹腔注射麻醉,取肝臟組織,置于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱備檢。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 餐后血糖(postprandial blood glucose,PBG)及腹腔胰島素耐量(intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT)檢測 電針干預(yù)前及干預(yù)8周后,對各組大鼠進行尾尖取血,用快速血糖儀測定大鼠PBG。電針干預(yù)6周后,對各組大鼠進行IPITT檢測,所有大鼠空腹12 h,尾尖取血測空腹血糖,然后行腹腔胰島素注射(1 U/kg),并測量注射后30、60、90、120 min的血糖值。

1.6.2 全身胰島素敏感性測定 電針干預(yù)8周后,每組大鼠各取3只行HEC檢測。術(shù)前大鼠禁食8 h,在尾根部注射局麻(2%利多卡因0.5 mL)。行尾動脈插管,接裝有肝素生理鹽水的注射器。尾靜脈插管并分別連接肝素生理鹽水及小三通。小三通管分別連接胰島素注射液和30%葡萄糖注射液。取尾動脈血0.5 mL測基礎(chǔ)血糖。接著以恒定速度[0.25 U/(kg·h)]輸入胰島素,每5 min測1次血糖并調(diào)整GIR,使血糖保持在穩(wěn)定范圍內(nèi)(基礎(chǔ)血糖±0.5 mmol/L)。共采血24次,取60 min～120 min的GIR,求平均值,其值越低,表示IR越嚴(yán)重。

1.6.3 Western blot法檢測大鼠肝臟組織中SIRT1、ATG7、p-GSK-3β蛋白表達 提取肝臟組織總蛋白,測定樣品蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳,之后進行轉(zhuǎn)膜,封閉1 h,除去封閉液,加入一抗[β-actin(1∶10000);SIRT1(1∶1000);ATG7(1∶1000);GSK-3β(1∶2000)]4℃孵育過夜?；厥找豢?用TBST洗3次,每次5 min。加入稀釋好的二抗,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次,每次5 min。進行化學(xué)發(fā)光檢測,分析蛋白相對表達量。

1.6.4 免疫共沉淀技術(shù)檢測ATG7蛋白乙酰化的水平 細胞充分裂解后取上清。加入抗體,4℃緩慢搖動孵育過夜,加入Agarose protein A+G,置于4℃搖轉(zhuǎn)儀中反應(yīng)6 h。離心5 min,棄上清,留沉淀于管中,用預(yù)冷的PBS洗滌上述沉淀3遍。收集沉淀,加入上樣緩沖液重懸,沸水煮5 min。Western blot法檢測乙酰化ATG7水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 模型評價

與正常組比較,造模后高脂喂養(yǎng)組大鼠GIR顯著降低(P<0.05),說明IR大鼠模型制備成功。見圖1。

與正常組比較,*P<0.05;n=3圖1 造模后正常組與高脂組大鼠GIR的比較Fig.1 Comparison of GIR between normal group and high-fat group

2.2 各組大鼠PBG、IPITT、GIR比較

與正常組相比,模型組PBG顯著升高(P<0.01),GIR顯著降低(P<0.01);與模型組相比,電針組PBG顯著降低(P<0.05),GIR顯著升高(P<0.01),SIRT1激活劑組GIR顯著升高(P<0.05);與電針組相比,SIRT1抑制劑+電針組GIR顯著降低(P<0.05)。在IPITT實驗中,60、90、120 min時,模型組IPITT水平均顯著高于正常組(均P<0.01),電針組與SIRT1激活劑組IPITT水平均顯著低于模型組(均P<0.05)。見圖2。

A:GIR檢測(n=3);B:PBG檢測(n=8);C:IPITT檢測(n=8);1:正常組;2:模型組;3:電針組;4:SIRT1激活劑組;5:SIRT1抑制劑+電針組;與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05 ##P<0.01;與電針組比較,△P<0.05圖2 各組大鼠PBG、IPITT、GIR的比較Fig.2 Comparison of PBG、IPITT and GIR of rats in each group

2.3 各組大鼠肝臟組織p-GSK-3β蛋白表達比較

與正常組相比,模型組肝臟組織p-GSK-3β蛋白表達顯著升高(P<0.01);與模型組相比,電針組肝臟組織p-GSK-3β蛋白表達顯著降低(P<0.01),SIRT1激活劑組肝臟組織p-GSK-3β蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3。

1:正常組;2:模型組;3:電針組;4:SIRT1激活劑組;5:SIRT1抑制劑+電針組;與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05 ##P<0.01;n=8圖3 各組大鼠肝臟p-GSK-3β蛋白表達比較Fig.3 Comparison of p-GSK-3β protein expression levels in rat liver tissues in each group

2.4 各組大鼠肝臟組織SIRT1、ATG7蛋白表達比較

與正常組相比,模型組肝臟組織SIRT1、ATG7蛋白表達顯著降低(均P<0.01);與模型組相比,電針組肝臟組織SIRT1、ATG7蛋白表達顯著升高(均P<0.01),SIRT1激活劑組肝臟組織SIRT1、ATG7蛋白表達顯著升高(均P<0.01),SIRT1抑制劑+電針組肝臟組織ATG7蛋白表達顯著升高(P<0.05);與電針組相比SIRT1抑制劑+電針組肝臟組織ATG7蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖4。

1:正常組;2:模型組;3:電針組;4:SIRT1激活劑組;5:SIRT1抑制劑+電針組;與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05 ##P<0.01;與電針組比較,△P<0.05;n=8圖4 各組大鼠肝臟組織SIRT1、ATG7蛋白表達比較Fig.4 Comparison of SIRT1 and ATG7 protein expression levels in rat liver tissues in each group

2.5 各組大鼠肝臟組織ATG7蛋白乙酰化水平比較

與正常組相比,模型組肝臟組織ATG7蛋白乙?；缴?與模型組相比,電針組肝臟組織ATG7蛋白乙?；浇档?SIRT1激活劑組肝臟組織ATG7蛋白乙?；浇档?SIRT1抑制劑+電針組肝臟組織ATG7蛋白乙?；浇档?與電針組相比SIRT1抑制劑+電針組肝臟組織ATG7蛋白乙?；缴摺Ｒ妶D5。

3 討論

IR與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),早期干預(yù)IR提高胰島素敏感性,對防治IR相關(guān)疾病具有重要意義。從中醫(yī)角度分析,IR的產(chǎn)生多與痰濁內(nèi)阻,脾腎虧虛有關(guān)[11],因此,治療IR應(yīng)從化痰祛濕,補益脾腎立法。大量研究表明,針灸可有效治療IR相關(guān)疾病[12-14]。且基于眾多專家治療IR的選穴經(jīng)驗,發(fā)現(xiàn)中脘、關(guān)元、足三里、豐隆為治療IR的首選穴[15]。其中中脘可健脾化濕,豐隆可化痰開竅,兩者配合可化痰祛濕;關(guān)元可固本培元,足三里可健脾益氣,兩者配合可補益脾腎。因此本實驗選取上述四穴進行電針治療。大量研究顯示2 Hz低頻電針能夠有效地改善IR[16-18],且在前期實驗中也得到驗證[8-9],因此本實驗繼續(xù)沿用2 Hz電針干預(yù)IR大鼠,并觀察其效應(yīng)。在電針強度、留針時間,以及干預(yù)頻次和療程上,至今還沒有統(tǒng)一方案。因此,本實驗結(jié)合課題組以往的研究結(jié)果,考慮實驗安全性,最終將電針參數(shù)定為2 Hz,1 mA,連續(xù)波,每日電針10 min,每周治療3次,總療程8周。

肝臟是胰島素信號調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的重要器官之一,GSK-3β是參與肝糖代謝的關(guān)鍵酶。有研究表明,降低GSK-3β的磷酸化水平,促進GSK-3β蛋白底物GS的正性表達,能夠提高胰島素信號通路的傳導(dǎo),增強胰島素的敏感性,改善肝臟IR[19]。因此p-GSK-3β可反應(yīng)肝臟胰島素敏感性水平。采用HEC檢測大鼠GIR,可較好地反映全身胰島素敏感性,為評估IR的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組PBG、IPITT水平顯著上升,GIR顯著下降,p-GSK-3β蛋白表達顯著上升,證明高脂誘導(dǎo)的大鼠存在胰島素敏感性降低的現(xiàn)象。電針干預(yù)后,大鼠PBG、IPITT、GIR、p-GSK-3β蛋白表達變化均被逆轉(zhuǎn),證明電針可以提高大鼠胰島素敏感性,改善IR,這與前期研究結(jié)果一致[8-9]。

SIRT1是一種NAD+依賴性去乙?；?影響多種組織與器官的能量代謝[20]。SIRT1通過對靶蛋白的乙?；{(diào)控參與基因轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡、代謝等多個過程[21]。據(jù)研究表明,SIRT1可以通過刺激胰島素分泌、調(diào)控胰島素信號通路與降低炎癥反應(yīng)等途徑,提高機體胰島素敏感性,改善IR[22]。白藜蘆醇為SIRT1的激活劑,可提高SIRT1去乙?；富钚?增強胰島素敏感性[23],在整體條件下減少喂飼高脂肪引起的IR。EX527為SIRT1的抑制劑,可抑制SIRT1去乙?；富钚訹24],是與白藜蘆醇做對比實驗的理想藥劑。ATG7是一種蛋白因子,有研究表明其表達水平與細胞自噬密切相關(guān),SIRT1可通過去乙酰化ATG7,從而促進細胞的自噬[25]。而自噬可以提高肝臟胰島素敏感性,抑制肝細胞自噬,則導(dǎo)致肝臟胰島素敏感性降低[26-28]。因此,電針改善IR的機制可能與其激活SIRT1表達,去乙?；饔糜贏TG7,促進細胞自噬,從而改善胰島素敏感性有關(guān)。本實驗以SIRT1激活劑為對照,觀察肝臟SIRT1對ATG7的去乙?；饔?運用SIRT1特異性抑制劑EX527,結(jié)合電針效應(yīng)的變化,揭示電針通過SIRT1/ATG7信號通路改善IR的作用機制。本研究結(jié)果提示當(dāng)SIRT1表達降低時,ATG7乙?；缴?從而引起IR;當(dāng)SIRT1表達升高時,ATG7乙酰化水平降低,從而改善IR。說明電針可以通過調(diào)節(jié)SIRT1、ATG7表達,提高胰島素敏感性,改善IR,但SIRT1/ATG7只是電針作用于大鼠肝臟組織,改善IR的途徑之一,并不是唯一途徑。由此可推論,電針可能通過激活肝臟SIRT1,去乙?；饔糜贏TG7,從而改善IR。

大量的研究證實了電針可以通過SIRT1介導(dǎo)的信號通路改善IR。黃琪等[29]建立肥胖大鼠模型,運用電針對其進行治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針可改善肥胖大鼠胰島素敏感性,其機制可能與SIRT1/NF-κB信號通路有關(guān)。楊亞南等[30]通過實驗研究發(fā)現(xiàn),電針增強肥胖大鼠胰島素敏感性,改善IR,其機制可能與電針調(diào)控SIRT1/FoxO1通路有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn),標(biāo)本配穴電針提高股四頭肌SIRT1蛋白表達水平可能是其增強IR大鼠胰島素敏感性、改善IR的重要機制之一[31]。本實驗研究顯示,電針能夠提高IR大鼠肝臟與全身胰島素敏感性,改善IR,其機制與電針激活肝臟SIRT1,干預(yù)ATG7乙酰化作用有關(guān)。與上述眾多實驗報道相一致。

綜合上述內(nèi)容,電針療法可提高IR大鼠全身及肝臟胰島素敏感性,有效改善IR,其作用機制可能與電針激活肝臟SIRT1/ATG7信號通路有關(guān)。本研究深入探討電針通過SIRT1介導(dǎo)的信號通路改善胰島素抵抗的作用與機制,不僅為針灸臨床防治胰島素抵抗提供有效的理論和實驗依據(jù),而且有助于在世界范圍內(nèi)推廣針灸防治胰島素抵抗相關(guān)疾病,造福于人類。