馬 敬, 仲照?！? 岳凌峰, 王瑜璞, 李 炎

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1心境障礙一科 2精神四科,新鄉(xiāng) 453000

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是老年人群中常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡引起的紋狀體多巴胺減少,臨床表現(xiàn)出靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩等運(yùn)動癥狀,同時部分患者還伴有抑郁、睡眠障礙、癡呆等非運(yùn)動癥狀,其中以抑郁最為常見[1-2]。臨床統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),帕金森病發(fā)病過程中,約有一半以上的患者會出現(xiàn)抑郁癥狀,不僅增加患者精神痛苦,還會加重患者認(rèn)知功能和身體運(yùn)動損傷,進(jìn)一步加重帕金森病情,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3]。目前,帕金森病抑郁癥(Parkinson’s disease depression,PDD)的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,其治療也以抗抑郁藥物治療為主。阿立哌唑(Aripiprazole)是一類新型的抗精神分裂癥藥物,可雙向調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)[4]。Luan等[5]研究顯示,輔助應(yīng)用Aripiprazole治療難治性抑郁癥有較好的療效和安全性。但Aripiprazole對PDD癥狀是否有緩解作用尚未可知。本研究通過構(gòu)建PDD大鼠模型,觀察Aripiprazole對PDD大鼠行為學(xué)的作用,并初步分析其相關(guān)機(jī)制,旨在為Aripiprazole應(yīng)用于PDD治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源

60只SD大鼠,SPF級,雄性,體質(zhì)量180～220 g,6～8周齡,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物合格證編號為SCXK(京)2019-0125,飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、相對濕度60%～70%、12 h晝夜交替的動物房中,自由攝食飲水,實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥品與主要試劑

Aripiprazole(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H20140121,規(guī)格10 mg/片);6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)試劑盒(美國Sigma);TUNEL試劑盒(美國Promega);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);蛋白一抗(美國Abcam)。

1.3 PDD模型的構(gòu)建

采用6-OHDA紋狀體雙靶點(diǎn)注射法及慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激法(chronic unpredictable mild stress,CUMS)制備PDD大鼠模型[6],具體操作如下:腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,并將大鼠頭顱固定于腦立體定位儀,去毛備皮,沿正中矢狀線剪開頭皮,暴露前囟,確定右側(cè)紋狀體注射點(diǎn),于相應(yīng)位點(diǎn)處顱骨鉆孔,再緩慢注入15 μg 6-OHDA,術(shù)后以醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合頭皮消毒,腹腔注射80000 U青霉素鈉抗感染,并注意保暖。術(shù)后6周時,背部皮下注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡,誘導(dǎo)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn),注射10 min后觀察并記錄大鼠60 min內(nèi)自然旋轉(zhuǎn)圈數(shù),若旋轉(zhuǎn)≥6圈/min提示PD模型構(gòu)建成功。取PD大鼠進(jìn)行21 d CUMS,包括24 h禁食、24 h禁水、5 min水平搖晃、2 h閃光刺激、6 h潮濕鼠籠、5 min 50 ℃環(huán)境、5 min 4 ℃冷水游泳、24 h晝夜顛倒、1 min夾尾、10 s足底電擊,上述10種刺激隨機(jī)分配到21 d中,每天1種刺激,并避免同種刺激連續(xù)使用,通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評估PDD模型。

1.4 動物分組與處理

60只SD大鼠隨機(jī)分為5組:健康對照組、模型組(PDD組)、低、中、高劑量Aripiprazole處理組,每組12只。除健康對照組外,其余大鼠均構(gòu)建PDD模型,健康對照組大鼠以生理鹽水進(jìn)行外紋狀體雙靶點(diǎn)注射,不予以應(yīng)激刺激。低、中、高劑量Aripiprazole處理組于建模后分別灌胃1.25、2.5、5 mg/kg Aripiprazole,1次/d,連續(xù)灌胃21 d[7]。健康對照組和PDD組以生理鹽水替代藥物灌胃。

1.5 大鼠行為學(xué)觀察

1.5.1 曠場實(shí)驗(yàn) 將大鼠置于曠場反應(yīng)箱正中心方格內(nèi),記錄5 min內(nèi)大鼠的總移動路程及中心區(qū)域活動時間。

1.5.2 蔗糖溶液偏好實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前3 d,除給予大鼠正常飲食外,予以1%糖水飼喂,且裝有糖水瓶和普通飲水瓶隨機(jī)調(diào)換位置,以便大鼠自由選擇飲用。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后,禁水不禁食1 d,同時給予1%糖水和純水,12 h后更換水瓶位置,觀察并記錄大鼠24 h內(nèi)兩種水的飲用量,計(jì)算蔗糖偏好指數(shù)(蔗糖水飲用量/總飲用水量×100%)。

1.5.3 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 將Y迷宮的3個臂隨機(jī)標(biāo)記為A、B、C,將大鼠從交叉中心位放入,記錄大鼠5 min內(nèi)自由探索進(jìn)入3個臂的次序和進(jìn)入臂總次數(shù),若大鼠每次進(jìn)入的臂與前兩次進(jìn)入的不同則認(rèn)定為正確選擇,統(tǒng)計(jì)犯錯次數(shù)和新異臂進(jìn)入次數(shù)。

1.6 神經(jīng)功能損傷評價

處理完成后,采用Longa法評價大鼠神經(jīng)功能損傷情況,其中無神經(jīng)功能缺失癥狀、活動正常為0分;提尾時健側(cè)不能完全伸展為1分;爬行時向健側(cè)轉(zhuǎn)圈行走為2分;行走時身體向健側(cè)傾倒為3分;無法自行行走、喪失意識、昏迷為4分。

1.7 腦組織5-HT和5-HIAA含量檢測

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,加入0.1 mol/L高氯酸勻漿,10000 r/min離心10 min,取上清檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物(5-HT、5-HIAA)的含量,具體操作參照試劑盒說明書。

1.8 大鼠腦組織損傷觀察

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,行常規(guī)石蠟切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察腦組織病理損傷。

1.9 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡觀察

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,行常規(guī)石蠟切片,置于二甲苯中脫蠟,經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌后,添加TUNEL檢測試劑,避光條件下反應(yīng)45 min,加入DAPI染劑孵育5 min,光鏡下觀察并拍照,計(jì)數(shù)染色陽性(凋亡)細(xì)胞數(shù),計(jì)算凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占比(凋亡指數(shù))。

1.10 外周血代謝相關(guān)酶活性檢測

處理完成后,收集腹主動脈血,7500 r/min離心10 min,取上清采用比色法,測定血清LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.11 蛋白印跡法檢測凋亡和代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)

處理完成后,斷頭處死大鼠,冰上快速剝離腦組織,加入適量液氮研磨,經(jīng)蛋白裂解液提取總蛋白,各組取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳,待蛋白完全分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,再將轉(zhuǎn)以后的膜放入5%的脫脂奶粉中,搖床上室溫反應(yīng)2 h,然后置于1∶1000一抗工作液中,4℃搖床反應(yīng)過夜,次日置于1∶10000二抗工作液中,搖床上室溫反應(yīng)1 h,最后添加化學(xué)發(fā)光劑,經(jīng)凝膠成像及分析系統(tǒng),檢測生存素(Survivin)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)、腺苷酸活化蛋白激酶α1(adenosine activated protein kinase α1,AMPKα1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)的相對表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Aripiprazole對PDD大鼠抑郁樣行為的影響

與健康對照組比較,PDD組大鼠曠場移動路程、蔗糖偏好指數(shù)及新異臂進(jìn)入次數(shù)均減少,犯錯次數(shù)增加(均P<0.05),表現(xiàn)出明顯抑郁樣行為;與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著提高曠場移動路程、蔗糖偏好指數(shù)及新異臂進(jìn)入次數(shù),降低犯錯次數(shù)(均P<0.05),見表1。

表1 Aripiprazole對PDD大鼠抑郁樣行為學(xué)的影響Table 1 Effects of Aripiprazole on depression-like behaviors in PDD

2.2 Aripiprazole對PDD大鼠腦神經(jīng)損傷和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

如圖1,與健康對照組比較,PDD組大鼠腦神經(jīng)功能損傷評分升高,腦組織5-HT、5-HIAA含量降低(均P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著降低腦神經(jīng)功能缺損評分,并提高5-HT、5-HIAA含量(均P<0.05)。

A:腦神經(jīng)功能評分,B:腦組織5-HT含量,C:腦組織5-HIAA含量;1:健康對照組,2:PDD組,3～5:低、中、高劑量Aripiprazole處理組;與健康對照組比較,*P<0.05;與PDD組比較,#P<0.05;n=6圖1 Aripiprazole改善PDD大鼠腦神經(jīng)損傷和升高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平Fig.1 Aripiprazole improves brain nerve damage and increases monoamine neurotransmitter level in PDD rats

2.3 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織病理損傷的影響

如圖2,健康對照組大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、分布均勻,且無壞死細(xì)胞;模型組腦組織結(jié)構(gòu)缺損、分布紊亂,且存在大量的壞死細(xì)胞;Aripiprazole處理后PDD大鼠腦組織病理損傷明顯減輕,其中以中、高劑量Aripiprazole處理組改善更為顯著。

1:健康對照組;2:PDD組;3～5:低(3)、中(4)、高(5)劑量Aripiprazole處理組圖2 Aripiprazole改善PDD大鼠腦組織病理損傷(HE染色,×400)Fig.2 Aripiprazole improves pathological damage in brain tissues of PDD rats(HE staining,×400)

2.4 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖3,健康對照組、模型組(PDD組)、低、中、高劑量Aripiprazole處理組腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(6.21±1.35)%、(52.37±9.51)%、(48.64±11.27)%、(36.72±6.57)%、(19.37±5.24)%。各組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.127,P<0.01);與健康對照組比較,PDD組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著降低腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(均P<0.05)。

2.5 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4,與健康對照組比較,PDD組大鼠腦組織中Survivin表達(dá)降低,Bax/Bcl-2水平升高(均P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理組可顯著升高Survivin表達(dá),并降低Bax/Bcl-2水平(均P<0.05)。

2.6 Aripiprazole對PDD大鼠血清代謝相關(guān)酶活性的影響

與健康對照組比較,PDD組大鼠血清LDH含量升高,Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(均P<0.05)。

與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著降低血清LDH水平,并升高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(均P<0.05),見表2。

表2 Aripiprazole對PDD大鼠血清代謝相關(guān)酶活性的影響Table 2 Effects of Aripiprazole on activities of serum metabolism-related enzymes in PDD

2.7 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織中代謝相關(guān)通路的影響

如圖5,與健康對照組比較,PDD組大鼠腦組織中p-AMPKα1、PGC-1α及GLUT4表達(dá)降低(均P<0.05);與PDD組比較,中、高劑量Aripiprazole處理可顯著提高AMPKα1磷酸化水平以及PGC-1α和GLUT4的表達(dá)(均P<0.05)。

A:蛋白電泳條帶圖;B:各組p-AMPKα1/AMPKα1、PGC-1α及GLUT4表達(dá)的統(tǒng)計(jì)比較;1:健康對照組;2:PDD組;3～5:低、中、高劑量Aripiprazole處理組;與健康對照組比較,*P<0.05;與PDD組比較,#P<0.05;n=6圖5 Aripiprazole對PDD大鼠腦組織中代謝相關(guān)通路的影響Fig.5 Effects of Aripiprazole on metabolism-related pathways in brain tissues of PDD rats

3 討論

本研究應(yīng)用曠場實(shí)驗(yàn)、蔗糖溶液偏好實(shí)驗(yàn)及Y迷宮實(shí)驗(yàn),反映大鼠情緒,發(fā)現(xiàn)PDD大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為學(xué)改變,且存在運(yùn)動障礙;經(jīng)中、高濃度Aripiprazole處理后,蔗糖偏好指數(shù)及新異臂進(jìn)入次數(shù)的增加和犯錯次數(shù)的減少,說明Aripiprazole可改善PDD大鼠模型的抑郁情緒,這與Yoon等[8]臨床研究結(jié)果基本相符。

單胺類遞質(zhì)假說是研究最多最深入的抑郁癥發(fā)病機(jī)制之一,腦內(nèi)多巴胺、5-HT、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)及受體失調(diào),引起海馬、皮層等調(diào)節(jié)情緒腦區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的改變,最終導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[9]。而PD由于黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元缺失,降低多巴胺釋放,從而引起多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)與乙酰膽堿系統(tǒng)失調(diào),不僅引起肌張力增高、運(yùn)動減少等運(yùn)動癥狀,還會出現(xiàn)抑郁癥。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT主要參與情緒、體溫、認(rèn)知等功能的調(diào)節(jié),其腦內(nèi)含量與抑郁癥的病情密切相關(guān),多數(shù)臨床一線抗抑郁藥物主要靶向5-HT系統(tǒng),從而達(dá)到抗抑郁的作用[10]。本研究顯示,遭受應(yīng)激刺激的大鼠腦組織神經(jīng)功能出現(xiàn)明顯損傷,腦內(nèi)5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA含量明顯降低,經(jīng)中、高劑量Aripiprazole治療后,腦神經(jīng)功能損傷明顯減輕,5-HT和5-HIAA含量明顯增加,提示Aripiprazole對PDD大鼠的抗抑郁作用機(jī)制可能與影響腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)系統(tǒng),增加5-HT和5-HIAA含量有關(guān)。

既往對PD患者的臨床病理學(xué)研究、基礎(chǔ)研究均表明,腦內(nèi)細(xì)胞凋亡與PD密切相關(guān)[11-12]。當(dāng)腦組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變時,往往伴隨著神經(jīng)細(xì)胞損傷,這與抑郁癥狀、認(rèn)知功能障礙的發(fā)生也存在聯(lián)系[13]。TUNEL染色發(fā)現(xiàn),PDD大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著上升,提示腦組織細(xì)胞凋亡是PDD大鼠腦功能損傷的重要表現(xiàn)。體內(nèi)細(xì)胞凋亡過程受多種途徑的共同調(diào)控,其中線粒體途徑主要通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax比例,影響線粒體通透性,最終激活下游半胱天冬酶家族級聯(lián)反應(yīng)[14]。Survivin是一種強(qiáng)效的抗凋亡因子,可介導(dǎo)半胱天冬酶家族抑制細(xì)胞凋亡過程,并增強(qiáng)細(xì)胞增殖的潛能[15]。本研究中,Aripiprazole治療可提高PDD大鼠腦組織中Survivin表達(dá),并降低Bax/Bcl-2水平,表明Aripiprazole可能通過抑制腦組織細(xì)胞的凋亡,保護(hù)PDD大鼠的腦損傷,這與kim等[16]研究報(bào)道Aripiprazole在缺血性卒中后抑郁小鼠中的抗凋亡作用一致。

腦能量代謝異常常見于PD、腦缺血、腦挫裂傷等。研究證實(shí),抑郁癥患者腦內(nèi)可出現(xiàn)明顯的能量代謝紊亂,提示能量代謝損傷可能是抑郁癥臨床癥狀的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[17]。LDH是機(jī)體糖無氧酵解的重要指標(biāo),可敏感反映體內(nèi)能量代謝情況[18]。ATP作為主要的能量物質(zhì),Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是參與主動轉(zhuǎn)運(yùn)離子泵的核心成分,可維持細(xì)胞內(nèi)外的離子交換,也是代謝紊亂及組織損傷的標(biāo)記物[19]。AMPK/PGC-1α是重要的能量代謝信號調(diào)控通路,AMPK亞基AMPKα1活化狀態(tài)可啟動PGC-1α,增加GLUT4表達(dá),促進(jìn)葡萄糖的攝取[20]。本研究結(jié)果顯示,血清LDH含量升高,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力及腦組織p-AMPKα1/AMPKα1、PGC-1α及GLUT4表達(dá)降低可能與PDD大鼠抑郁行為變化有關(guān),Aripiprazole可降低LDH水平,提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力,p-AMPKα1/AMPKα1、PGC-1α及GLUT4的表達(dá),改善模型大鼠腦內(nèi)能量代謝,這可能是Aripiprazole在PDD大鼠中抗抑郁作用的重要分子機(jī)制。

綜上所述,阿立哌唑可改善帕金森病抑郁癥大鼠抑郁樣行為,其機(jī)制可能與增加單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、抑制腦組織細(xì)胞凋亡、改善能量代謝有關(guān)。但阿立哌唑是否存在其他的作用途徑改善PDD癥狀,仍有待進(jìn)一步研究明確。