余 丹, 陳彰強, 彭曉紅

武漢市第四醫(yī)院麻醉科,武漢 430033

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是由于圍生期新生兒缺氧缺血而導致的腦損傷,可造成患兒腦性癱瘓、認知功能障礙、癲癇等神經(jīng)后遺癥[1-2]。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一種選擇性α腎上腺素能受體激動劑,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流且無呼吸抑制的作用。研究顯示,右美托咪定對缺血缺氧新生大鼠腦損傷具有保護作用[3],還可減輕老齡大鼠術后認知功能障礙[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一種組蛋白脫乙酰化酶,可通過去乙?；饔脜⑴c氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)保護等作用。研究顯示SIRT1可激活下游腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),BDNF參與神經(jīng)存活與發(fā)生,其水平升高可改善學習記憶功能障礙[5-6]。研究顯示,SIRT1通過調(diào)節(jié)HMGB1表達進而調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,參與抗神經(jīng)炎癥反應,在新生兒HIBD中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]。研究表明,右美托咪定通過調(diào)節(jié)SIRT1信號通路,減輕創(chuàng)傷性腦損傷大鼠病理損害,起保護神經(jīng)的作用[8]。右美托咪定對HIBD引起的認知功能障礙的作用及機制尚不清楚,本研究在驗證右美托咪定保護腦HIBD損傷的基礎上,觀察右美托咪定對HIBD引起認知功能障礙及SIRT1/BDNF信號通路的影響,初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

7日齡SPF級新生SD大鼠,體重12～16 g,購自武漢大學動物實驗中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2019-0004。

1.2 主要藥物和試劑

鹽酸右美托咪定注射液(2 mL:0.2 mg)購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司;SIRT1抑制劑EX527(E7034)購自Sigma公司;One-step TUNEL Apoptosis Kit(E-CK-A321)購自Elabscience;通用SP檢測試劑盒(SP0041)、TTC染色液(G3005)購自Solarbio公司;兔抗突觸后致密蛋白-95(postsynaptic dense protein-95,PSD95)(AF1096)、SIRT1(ab189494)、cAMP反應元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)(AF1018)、pCREB(AF5785)、BDNF(AF1423)抗體購自Beyotime公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型復制及分組 采用改良Rice法[9]復制HIBD大鼠模型:新生大鼠吸入3%異氟烷麻醉,沿頸部正中切口,分離左頸總動脈,結(jié)扎并縫合傷口,將大鼠置于缺氧環(huán)境中(92% N2+8% O2)4 h,對照組僅游離頸總動脈,不做缺氧缺血處理。

實驗大鼠隨機分為對照組(Control組)、模型組(HIBD組)、Dex組、Dex+EX527組,造模后,Dex組使用100 μg/kg右美托咪定腹腔注射給藥,給藥劑量參照文獻[6];Dex+EX527組使用100 μg/kg右美托咪定腹腔注射給藥與10 μg EX527術前側(cè)腦室注射給藥;Control組與HIBD組給予等量的生理鹽水。

大鼠缺氧4 h后,對大鼠進行Zea Longa評分[10],0分表示神經(jīng)癥狀正常,1～3分表示造模成功,剔除0、4、5分大鼠,隨機補充保證每組10只大鼠。

1.3.2 Morris水迷宮實驗與空間探索實驗 給藥結(jié)束后,以Morris水迷宮[11]檢驗大鼠學習記憶功能。保持水溫25℃左右,實驗第1天為適應性訓練,剔除有運動障礙的大鼠,實驗第2(D2)、4(D4)、6(D6)天的同一時間點從水池4個象限點放入大鼠,記錄大鼠2 min內(nèi)登上平臺時間;若在2 min內(nèi)大鼠未找到平臺,則人為引導大鼠找到平臺并記錄時間為2 min。第6天水迷宮實驗結(jié)束后移走平臺,將大鼠從水池4個象限點放入水中,記錄大鼠在2 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)和穿越平臺的時間。

1.3.3 TTC染色檢測腦梗死面積 水迷宮實驗結(jié)束后,每組隨機取5只大鼠處死,取腦組織冰凍后切成厚度為2 mm的切片,選同一部位切片采用4%多聚甲醛固定及TTC染色法染色,采用Image J 1.8.0軟件分析切片腦梗死面積,即該切片切面的腦梗死面積占總面積的百分比,其中正常腦組織顯紅色,梗死組織顯白色。

1.3.4 TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡 取各組大鼠腦組織同一部位冰凍切片,根據(jù)One-step TUNEL Apoptosis Kit說明書進行TUNEL染色,DAPI復染細胞核,熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元凋亡。隨機選擇5個視野,計算平均凋亡率,神經(jīng)元凋亡率=顯示綠色熒光細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.5 免疫組化檢測海馬組織PSD95表達 另外5只大鼠處死后取海馬組織,一部分組織-80℃保存,另一部分組織4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片,免疫組化法檢測海馬組織PSD95表達,隨機選擇3個視野,顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)染色陽性細胞數(shù)。

1.3.6 Western blot檢測大鼠海馬組織SIRT1、CREB、pCREB、BDNF蛋白表達 各組剩余海馬組織用液氮研磨,加入RIPA裂解液離心提取總蛋白,取適量樣品煮沸變性后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜,加入兔抗鼠SIRT1、CREB、pCREB、BDNF一抗稀釋液,4℃孵育過夜,加二抗,顯色曝光,以β-actin為內(nèi)參分析目的蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對HIBD大鼠認知功能的影響

與Control組比較,HIBD組大鼠在D2、D4、D6逃避潛伏期顯著延長(均P<0.05),空間探索時間明顯增加,穿越平臺次數(shù)明顯減少(均P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠在D2、D4、D6逃避潛伏期明顯縮短(均P<0.05),空間探索時間明顯減少,穿越平臺次數(shù)明顯增加(均P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠在D2、D4、D6逃避潛伏期明顯延長(均P<0.05),空間探索時間明顯增加,穿越平臺次數(shù)顯著減少(均P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較Table 1 Comparison of the water maze test results of rats in each

2.2 右美托咪定對HIBD大鼠神經(jīng)功能及腦梗死面積的影響

Control組大鼠腦組織沒有出現(xiàn)梗死現(xiàn)象,神經(jīng)功能評分為0;HIBD組大鼠腦組織白色區(qū)域增多,說明有明顯的梗死灶形成,其腦梗死面積與神經(jīng)功能評分均較Control組顯著增加(均P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠腦組織白色區(qū)域減少,梗死面積與神經(jīng)功能評分顯著減少(均P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠腦梗死面積與神經(jīng)功能評分顯著增加(均P<0.05),見圖1。

與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死面積Fig.1 Neurological function score and cerebral infarction area of rats in each group

2.3 右美托咪定對HIBD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL染色凋亡神經(jīng)元顯示綠色,與Control組比較,HIBD組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖2。

與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖2 各組大鼠神經(jīng)元凋亡(TUNEL染色,×200)Fig.2 Neuron apoptosis of rats in each group(TUNEL,×200)

2.4 右美托咪定對HIBD大鼠海馬組織PSD95表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示,與Control組比較,HIBD組大鼠海馬組織PSD95陽性表達率顯著降低(P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠海馬組織PSD95陽性表達率顯著升高(P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠海馬組織PSD95陽性表達率顯著降低(P<0.05),見圖3。

與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖3 各組大鼠海馬組織PSD95表達(免疫組化染色,×100)Fig.3 Expression of PSD95 in hippocampus of rats in each group(Immunohistochemical staining,×100)

2.5 右美托咪定對HIBD大鼠海馬組織SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示,與Control組比較,HIBD組大鼠海馬組織SIRT1、BDNF蛋白表達水平及pCREB/CREB顯著降低(均P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠海馬組織SIRT1、BDNF蛋白表達水平及pCREB/CREB顯著升高(均P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠海馬組織SIRT1、BDNF蛋白表達水平和pCREB/CREB顯著降低(均P<0.05),見圖4。

1:Control組;2:HIBD組;3:Dex組;4:Dex+EX527組;與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖4 各組大鼠海馬組織SIRT1、CREB、pCREB、BDNF蛋白表達Fig.4 Expression of SIRT1,CREB,pCREB and BDNF protein in hippocampus of rats in each group

3 討論

HIBD是引起新生兒死亡和殘疾的主要原因,高達25%的患兒遺留永久性神經(jīng)后遺癥,即使經(jīng)過低溫治療仍有后遺癥的發(fā)生[12]。缺血缺氧是HIBD重要的病理生理過程,可引起腦組織發(fā)生病理變化,如梗死與神經(jīng)元凋亡,其中海馬組織CA1區(qū)是學習、記憶的重要區(qū)域,組織損傷可引起認知功能障礙[13]。PSD95為神經(jīng)細胞骨架蛋白,在神經(jīng)功能與發(fā)育方面有重要作用,可反映學習記憶功能,在認知功能障礙的大鼠海馬中PSD95表達水平降低[14]。本研究結(jié)果顯示,給予HIBD模型大鼠右美托咪定治療后,大鼠逃避潛伏期明顯縮短,空間探索時間明顯減少,穿越平臺次數(shù)明顯增加,腦梗死面積與神經(jīng)功能評分、神經(jīng)元凋亡率顯著降低,海馬組織PSD95陽性表達率升高,表明右美托咪定可減輕HIBD大鼠神經(jīng)損傷與認知功能障礙。

右美托咪定具有抗焦慮、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流動力學等作用,在改善缺血缺氧引起腦損傷和神經(jīng)功能方面發(fā)揮重要作用。另外,右美托咪定還可改善氣道的壓力和順應性,無呼吸抑制作用[15]。Gao等[16]研究顯示,右美托咪定可通過線粒體途徑抑制神經(jīng)元凋亡,介導神經(jīng)珠蛋白表達而發(fā)揮對缺氧復氧模型大鼠的神經(jīng)保護作用。楊悅等[17]研究顯示,右美托咪定可激活Wnt/GSK-3β/β-鏈蛋白信號通路抑制七氟醚誘導的大鼠神經(jīng)元凋亡,并改善大鼠認知功能障礙。本研究結(jié)果與既往報道結(jié)果類似,且本研究還發(fā)現(xiàn),右美托咪定改善HIBD大鼠神經(jīng)損傷及認知功能障礙的作用可被SIRT1抑制劑逆轉(zhuǎn),推測右美托咪定可能通過激活SIRT1信號通路減輕HIBD引起的大鼠認知功能障礙。研究顯示,SIRT1信號通路在缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認知功能障礙中發(fā)揮重要作用[18]。

SIRT1是NAD+依賴的去乙?；?在腦組織中主要表達于海馬神經(jīng)元,通過去乙酰作用參與氧化應激、炎癥反應,在參與神經(jīng)保護作用方面發(fā)揮重要作用[19]。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子,參與突觸的正常生長、發(fā)育和可塑性,對缺血缺氧性腦損傷的神經(jīng)元具有保護作用,SIRT1可通過調(diào)節(jié)CREB的表達進而影響B(tài)DNF的表達,BDNF是CREB最重要的靶蛋白之一,CREB的磷酸化(pCREB)可增強BDNF的轉(zhuǎn)錄激活,在學習、記憶和情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]。SIRT1/BDNF信號通路激活可改善血管性認知障礙大鼠的學習記憶功能和腦缺血再灌注大鼠的認知功能[21-22]。本研究結(jié)果顯示,使用右美托咪定治療HIBD模型大鼠后,HIBD大鼠海馬組織SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表達水平顯著升高,提示右美托咪定可能激活SIRT1/BDNF信號通路;而使用SIRT1抑制劑EX527可顯著下調(diào)SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表達水平,并且逆轉(zhuǎn)右美托咪定HIBD大鼠腦組織損傷及認知功能的抑制作用,表明右美托咪定可通過激活SIRT1/BDNF通路保護HIBD大鼠腦神經(jīng)損傷,改善認知功能障礙。右美托咪定是通過何種途徑影響SIRT1的表達,仍需做深入研究。研究顯示,AMPK是SIRT1的激活劑,同時SIRTl的過度表達可激活下游的AMPK,表明二者可通過能量代謝發(fā)揮獨立或協(xié)同作用[23]。右美托咪定可通過調(diào)節(jié)AMPK,影響SIRT1表達,進而影響pCREB,增強BDNF的轉(zhuǎn)錄激活。研究顯示[24],行肝葉切除術的患者在麻醉之后分別以0.3 μg/(kg·h)或0.6 μg/(kg·h)的的速率靜脈泵注右美托咪定,直至手術完成,患者發(fā)生術后譫妄和術后認知功能障礙的比例較對照組顯著降低,提示右美托咪定對改善認知功能障礙有一定臨床應用意義。

綜上所述,右美托咪定可通過激活SIRT1/BDNF信號通路,改善HIBD新生大鼠神經(jīng)功能損傷與認知功能障礙。本研究為HIBD引起的認知功能障礙的治療提供了新思路。