鄧方方, 李繼勇, 張 力, 鄒高銳, 陳治軍, 樂 薇

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院,武漢市第一醫(yī)院 1麻醉科 2針灸科,武漢 430022

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)指的是缺血的心肌在恢復灌注時其結構被進一步破壞甚至出現(xiàn)心肌梗死范圍擴大等現(xiàn)象,對患者預后造成嚴重影響[1-2]。探索MIRI中的分子機制對揭示其復雜病理機制,提高MIRI患者生存率具有重要意義。

在臨床實踐中,七氟醚作為一種吸入麻醉劑已被廣泛應用,已發(fā)現(xiàn)七氟醚可在體內外誘導缺血耐受[3],然而七氟醚對心肌細胞的保護作用及潛在機制仍有待進一步研究。N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物中最常見的mRNA修飾,研究表明m6A甲基化與心臟功能的維持密切相關[4]。脂肪和肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是一種RNA去甲基化酶,也被稱為“擦除蛋白”,已有研究表明FTO在老年小鼠缺血性心臟中表達降低[5]。另外,FTO也被發(fā)現(xiàn)能夠促進Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)的穩(wěn)定性進而改善缺氧/復氧(hypoxia/reoxgenation,H/R)誘導的心肌細胞損傷[6]。內向整流型鉀離子通道亞家族J成員2(potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 2,KCNJ2)以往被證實在MIRI中表達下調[7],但是其在MIRI中的機制仍有待進一步探討。

本研究通過構建MIRI細胞模型,探究七氟醚在MIRI中的具體機制,揭示七氟醚/FTO/KCNJ2通路在MIRI中發(fā)揮的可能作用。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

人心肌細胞系AC16購自中國科學院(上海)細胞庫。DMEM培養(yǎng)液(貨號PM150210B)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。七氟醚購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(貨號C0009S)購自上海碧云天生物技術有限公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(貨號A020-2-2)購自南京建成生物工程研究所。Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號40302ES20)和核糖體RNA去除試劑盒(貨號12253ES)購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。LipofectamineTM3000轉染試劑(貨號L3000015)購自北京誠聚德生物技術有限公司。FTO抗體(貨號ab280081)、KCNJ2抗體(貨號ab109750)、IgG抗體(貨號ab205718)和m6A抗體(貨號ab151230)購自英國Abcam公司。Trizol試劑(貨號R1030)購自北京普利萊基因技術有限公司。cDNA合成試劑盒(貨號YB-S052)購自上海鈺博生物科技有限公司。SYBR Green Supermix(貨號1725124)購自北京智杰方遠科技有限公司。RIPA裂解液(貨號P0013K)、BCA試劑盒(貨號P0012)購自碧云天生物。放線菌素D購自Sigma公司。RIP免疫沉淀試劑盒購自Millipore。CytoFLEX流式細胞儀購自貝克曼庫爾特國際貿易(上海)有限公司。SpectraMax M5e多功能酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。ABI 7000型定量PCR儀購自蘇州亞凡生物技術有限公司。

1.2 生物信息學分析

在基因表達綜合數(shù)據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)獲取MIRI相關數(shù)據集GSE160516,分析4例假手術組及12例MIRI大鼠心肌組織中的差異表達基因,差異篩選條件為adj.P.Value<0.05和|Log FoldChange|>1。通過DAVID數(shù)據庫對GSE160516芯片中差異表達基因做GO分析。在SRAMP網站(http://www.cuilab.cn/sramp)預測KCNJ2的m6A修飾位點。RPISeq網站(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/)預測KCNJ2和FTO的結合。

1.3 細胞培養(yǎng)及H/R損傷模型建立

將AC16細胞置于37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),分為Control組(空白對照組,以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在95%空氣和5% CO2混合氣體條件下培養(yǎng));H/R組:將細胞置于缺氧室(含95% N2和5% CO2)中以無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h,之后將無血清DMEM培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在95%空氣和5% CO2的條件下復氧處理3 h;七氟醚組:接受上述H/R處理,并在復氧前以97.6% O2和2.4%七氟醚處理20 min。

1.4 細胞轉染

設計并合成FTO和KCNJ2的小干擾RNA(si-FTO,si-KCNJ2),以各自的陰性對照si-NC作為對照。使用qRT-PCR擴增KCNJ2的互補DNA(cDNA)序列,將cDNA克隆至pcDNA3.1載體上,構建KCNJ2的過表達載體(pcDNA3.1-KCNJ2),以空載體(pcDNA3.1)為對照。AC16細胞在37℃、5%CO2的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),直到細胞達到90%融合,使用LipofectamineTM3000將上述siRNA或載體轉染至AC16細胞,48 h后進行相應處理,并采用qRT-PCR檢測轉染效率。

1.5 MTT法檢測細胞活力

將處理后的AC16細胞接種在48孔板(1×105個細胞/孔)中。將10 μL MTT試劑添加至各孔中,37℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)上清液,每孔加入100 μL Formazan溶解液,混勻后孵育直至Formazan全部溶解。使用多功能酶標儀記錄570 nm處的吸光度(A570nm)值。

1.6 微板法檢測LDH的釋放

將處理后的AC16細胞接種于96孔板(2×104個細胞/孔)中。在收集細胞上清液后,在測定孔中添加20 μL待測樣本、25 μL基質緩沖液和5μL輔酶Ⅰ,其余各孔依據試劑盒說明書進行添加,各孔混勻后在37℃溫浴15 min。各孔分別添加25 μL 2,4-二硝基苯肼,混勻后在37℃溫浴15 min。各孔分別添加250 μL NaOH溶液,混勻后在室溫下靜置5 min,在450 nm處測定吸光度值。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率

收集處理后的AC16細胞,300×g,4℃離心5 min,用預冷的PBS洗滌2次,吸棄PBS,加入100 μL 1×Binding buffer重懸細胞,加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI混勻,避光反應15 min,加入400 μL 1×Binding buffer,混勻后置于冰上,在1 h內使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.8 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用Trizol試劑提取總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒將1 μg總RNA合成cDNA。隨后,使用SYBR Green Supermix在ABI 7000型定量PCR儀上進行qRT-PCR。反應體系包括12.5 μL SYBR Green Supermix,上下游引物各1 μL,DNA模板2 μL和雙蒸水8.5 μL。反應程序為:95℃ 3 min,95℃ 5 s,60℃ 1 min,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。引物序列為:FTO正向5′-ACCTATGCTGACCATTCCAA-G-3′,反向5′-CTGTTGGTTCAGAAGGCTCTC-3′;KCNJ2正向5′-AGCACAATTCCAAAGGATGG-3′,反向5′-ATTGCGGGGAACTCTACCTT-3′;GAPDH正向5′-TGACCACAGTCCATGCC-ATCAC-3′,反向5′-GCCTGCTTCACCACCTTC-TTGA-3′。

1.9 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

RIPA裂解液裂解細胞,PBS沖洗、離心后借助BCA試劑盒測定蛋白濃度,行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳電壓80 V轉120 V,采用濕轉移法100 V恒壓轉膜,時間為30～60 min,之后采用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗FTO(1∶1000)、KCNJ2(1∶1000),孵育過夜后PBS沖洗,加入對應的二抗IgG(1∶2000)并在室溫條件下孵育1 h,洗膜后行ECL顯影、定影后借助Image J軟件測定蛋白濃度。

1.10 RNA結合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)

RIPA裂解緩沖液對心肌細胞進行裂解,之后將FTO抗體、m6A抗體和IgG抗體與A/G瓊脂糖珠在4℃孵育2 h?？俁NA與IP緩沖液中的抗體一起孵育,然后洗脫沉淀RNA。采用qRT-PCR進行定量分析。

1.11 放線菌素D(Actinomycin D,Act D)測定KCNJ2 mRNA的穩(wěn)定性

將心肌細胞接種在96孔板中(每孔1×105個細胞)常規(guī)培養(yǎng)。24 h后向培養(yǎng)細胞中添加2 μg/mL的Act D,并在3、6 h收集細胞,使用qRT-PCR分析未與Act D結合的KCNJ2 mRNA水平來判定RNA穩(wěn)定性,該水平與0 h的檢測水平做標準化。

1.12 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 七氟醚后處理減輕H/R后心肌細胞損傷

如圖1A所示,與Control組相比,H/R組細胞活力下降,而七氟醚組細胞活力較H/R組升高(均P<0.01)。此外,H/R組細胞LDH的釋放增加(P<0.01),而七氟醚后處理降低了LDH釋放水平(P<0.05,圖1B)。H/R組的細胞凋亡率較Control組顯著升高(P<0.01),而七氟醚組凋亡率較H/R組降低(P<0.01,圖1C、1D)。上述結果表明七氟醚后處理可有效減輕H/R誘導的心肌細胞損傷。

1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組;A:MTT法檢測細胞活力;B:LDH釋放量檢測;C～D:流式細胞術檢測細胞凋亡;與Control組比較,**P<0.01;與H/R組比較,#P<0.05 ##P<0.01 圖1 七氟醚后處理提高H/R處理心肌細胞的存活率并減輕損傷和凋亡Fig.1 Sevoflurane postconditioning improves survival rate of H/R-treated cardiomyocytes,and attenuates cell injury and apoptosis

2.2 生物信息學分析結果

GSE160516中的差異表達基因如圖2A所示。本研究將重點放在284個在MIRI中下調的基因上,對下調基因進行GO富集分析。在生物過程分析結果中發(fā)現(xiàn),KCNJ2富集在3個心臟相關通路中,因此選擇KCNJ2進行分析(圖2B)。對H/R組AC16細胞中KCNJ2的表達進行檢測,發(fā)現(xiàn)相對于Control組,H/R組細胞KCNJ2的表達量降低,而七氟醚處理后,經過H/R處理的AC16細胞KCNJ2的表達增強(均P<0.01)(圖2C、2D)。

1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組;A:GSE160516芯片差異表達基因火山圖;B:MIRI中下調基因的GO分析結果;C:H/R處理的AC16細胞中KCNJ2 mRNA的表達情況;D:H/R處理的AC16細胞中KCNJ2的蛋白表達;與Control組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖2 七氟醚后處理對H/R心肌細胞中KCNJ2表達的調節(jié)Fig.2 Regulation of KCNJ2 expression in H/R cardiomyocytes by sevoflurane postconditioning

2.3 敲減KCNJ2抑制七氟醚后處理對H/R心肌細胞的保護作用

MTT實驗結果顯示,相對于Control組,H/R組細胞的活力顯著降低,七氟醚處理后H/R細胞活力增強;而相對于七氟醚+si-NC組,七氟醚+si-KCNJ2組的細胞活力降低(圖3A)。此外,七氟醚能夠抑制H/R誘導的心肌細胞LDH釋放和細胞凋亡,但這一作用也可被轉染si-KCNJ2逆轉(圖3B、3C)。上述結果提示敲減KCNJ2能夠抑制七氟醚后處理對H/R心肌細胞的保護作用。

1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組,4:七氟醚+si-NC組,5:七氟醚+si-KCNJ2組;A:各組細胞活力;B:各組細胞LDH釋放水平;C:各組細胞凋亡情況;與Control組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01;與七氟醚+si-NC組比較,△P<0.05 △△P<0.01 圖3 敲減KCNJ2對七氟醚后處理的H/R心肌細胞的影響Fig.3 Effects of KCNJ2 knockdown on sevoflurane-treated H/R cardiomyocytes

2.4 FTO調控KCNJ2的表達

對KCNJ2在H/R誘導心肌細胞損傷中的機制進行探討,借助SRAMP網站預測KCNJ2的m6A修飾情況,發(fā)現(xiàn)KCNJ2存在多個高可信度m6A修飾位點(圖4A)。已被證實,FTO的表達下調能夠增強其修飾基因的m6A甲基化,進而降低其修飾基因的穩(wěn)定性。鑒于KCNJ2在H/R心肌細胞中表達下調且RPISeq網站分析提示FTO和KCNJ2存在較強結合分數(shù),因此本研究推測FTO能夠對KCNJ2的表達進行調控。RIP實驗進一步驗證了FTO和KCNJ2的結合(圖4B)。進一步分析過表達FTO對KCNJ2表達的影響,結果顯示,與Vector組比較,過表達FTO后(oe-FTO組)KCNJ2的m6A甲基化水平降低(P<0.01,圖4C),KCNJ2的穩(wěn)定性和蛋白表達量均提高(P<0.01,圖4D、4E),證實FTO能夠通過減少KCNJ2的m6A修飾進而增強其穩(wěn)定性。對H/R心肌細胞中m6A和FTO的表達水平進行檢測,結果顯示,與Control組比較,H/R組m6A水平增加而FTO表達水平降低,加入七氟醚處理后,m6A水平下降而FTO表達提高(P<0.01,圖4F、4G)。綜上,七氟醚處理能夠通過影響FTO的表達水平,進而對KCNJ2的表達進行調控,最終參與H/R誘導的心肌細胞損傷。

A:KCNJ2的m6A修飾位點預測結果;B:RIP檢測FTO和KCNJ2的結合;C:過表達FTO對KCNJ2和m6A結合情況的影響;D:過表達FTO對KCNJ2 mRNA穩(wěn)定性的影響;E:過表達FTO對KCNJ2蛋白表達的影響;F:各組細胞m6A水平檢測結果,1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組;G:各組細胞中FTO蛋白表達;Vector:空載體,oe-FTO:FTO過表達載體;**P<0.01圖4 FTO和KCNJ2的關系驗證Fig.4 Verification of the relationship between FTO and KCNJ2

2.5 敲減FTO能夠抑制七氟醚對H/R心肌細胞的保護作用且該作用可被KCNJ2過表達挽救

相對于七氟醚+si-NC組,七氟醚+si-FTO組的KCNJ2表達下調,細胞活力降低,LDH釋放量和細胞凋亡率增加(均P<0.01),提示敲減FTO能夠抑制七氟醚對H/R心肌細胞的保護作用。但相對于七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1組,七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1-KCNJ2組的細胞活力增強,LDH釋放水平和細胞凋亡率降低(均P<0.05),提示過表達KCNJ2能夠部分挽救si-FTO對七氟醚處理的H/R心肌細胞的影響。見圖5。

3 討論

本研究顯示,在MIRI體外細胞模型中,七氟醚通過促進FTO/KCNJ2的表達,減輕H/R誘導的心肌細胞損傷,為七氟醚后處理改善MIRI的機制做出新的解釋。

七氟醚作為吸入類麻醉藥物的一種,近年來其對心肌損傷的保護作用不斷被揭示,如有研究發(fā)現(xiàn)七氟醚對行冠狀動脈旁路移植術的患者具有心肌保護作用,且2%七氟醚吸入的抗炎效果最佳[8]。動物及細胞實驗也證實,七氟醚能夠通過AMPK途徑抑制由H/R引起的心肌細胞凋亡,從而在MIRI大鼠及細胞模型中發(fā)揮保護作用[9]。此外,七氟醚還可通過抑制PI3KC3介導的自噬減少H/R誘導的心肌細胞凋亡[10]。本研究為進一步闡明七氟醚對MIRI的保護作用機制,借助MIRI相關芯片篩選在MIRI中差異表達的基因,之后在表達下調基因中發(fā)現(xiàn)了KCNJ2,且KCNJ2被發(fā)現(xiàn)富集在3個心臟相關通路中。以往有研究表明KCNJ2表達的下調與心房顫動有關[11]。此外,KCNJ2功能的改變也被證實與遺傳性心臟猝死綜合征有關[12]。本研究發(fā)現(xiàn),相對于Control組細胞,H/R組細胞中KCNJ2的表達降低,但加入七氟醚后其表達上調。此外,敲減KCNJ2能夠抑制七氟醚對H/R誘導心肌細胞損傷的保護作用,提示上調KCNJ2可能對H/R誘導的心肌損傷發(fā)揮保護作用,這與Niu等[7]的研究結論一致。LDH是糖酵解酶的一種,其存在于機體的所有組織和細胞中,也是細胞損傷的一個重要標志物,當細胞損傷或者疾病發(fā)生的時候往往會出現(xiàn)LDH釋放水平的升高,其也被常用于心肌梗死、心肌損傷等多種病理情況的監(jiān)測[13-15]。

1:七氟醚+si-NC組,2:七氟醚+si-FTO組,3:七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1組,4:七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1-KCNJ2組;A:qRT-PCR檢測各組KCNJ2的表達;B:MTT法檢測細胞活力;C:LDH釋放量檢測;D～E:流式細胞術檢測細胞凋亡;F:研究機制示意圖;與七氟醚+si-NC組比較,**P<0.01;與七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1組比較,#P<0.05 ##P<0.01 圖5 過表達KCNJ2可部分挽救敲減FTO對七氟醚后處理的H/R心肌細胞的作用Fig.5 Overexpression of KCNJ2 partially reverses the effects of si-FTO on H/R myocardial cells after sevoflurane treatment

m6A修飾被證實影響多種疾病的進展,FTO是m6A系統(tǒng)中關鍵的去甲基化酶,當前已有研究表明FTO過表達對于保護H/R引起的心肌細胞損傷具有積極作用,如Shen等[16]發(fā)現(xiàn)FTO過表達可通過調節(jié)MHRT的m6A修飾進而抑制H/R導致的心肌細胞凋亡。此外,也有研究證實FTO能幫助維持鈣穩(wěn)態(tài),改善H/R導致的心肌細胞能量代謝改變[17]。本研究為證實KCNJ2在H/R心肌細胞中低表達是否與m6A修飾有關,借助SRAMP預測了其m6A修飾位點,結果顯示其存在多個m6A修飾位點,之后進一步借助RPISeq網站推測KCNJ2和FTO可能直接存在較強作用關系。鑒于以往研究提示FTO能夠解除其修飾基因的甲基化進而增強其修飾基因的穩(wěn)定性[6],我們推測KCNJ2在H/R誘導的心肌細胞中低表達或許與FTO表達下調有關。本研究首先通過RIP實驗證實了FTO和KCNJ2可以相互結合,進一步研究表明相對于Control組,H/R心肌細胞中FTO的表達被抑制,而加入七氟醚處理后FTO的表達增加,這也進一步提示FTO在H/R誘導的心肌細胞中表達失調并且能夠受七氟醚處理的影響。而過表達FTO后,KCNJ2的m6A修飾減少,KCNJ2的穩(wěn)定性和表達增強;敲減FTO后KCNJ2的表達降低,進一步揭示了FTO對KCNJ2表達的調控作用可能是通過影響其m6A修飾水平而實現(xiàn)。功能實驗進一步證明,在七氟醚后處理的H/R心肌細胞中敲減FTO能夠抑制心肌細胞活力,增加LDH釋放和凋亡,進而加重心肌細胞損傷;過表達KCNJ2后,這一情況部分改善,這也進一步揭示了FTO/KCNJ2參與七氟醚對H/R心肌細胞損傷的作用。

本研究也存在一定局限性,如未進一步探討七氟醚調控FTO/KCNJ2軸參與H/R誘導的心肌損傷中可能影響的信號通路,未進一步做更多體內實驗等,這也是我們后續(xù)需完善的方向。綜上所述,本研究揭示了七氟醚后處理能夠通過調節(jié)FTO/KCNJ2軸進而影響H/R誘導的心肌細胞損傷,聯(lián)合七氟醚處理以及FTO/KCNJ2軸干預對于改善H/R導致的心肌損傷具有重要意義。