劉 浪, 邱 承, 陳思奇, 胡福清, 王桂華, 徐 豐

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院胃腸外科,武漢 430030

賴氨酸特異性甲基轉(zhuǎn)移酶2(lysine specific methyltransferase 2,KMT2)是一個具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的同源蛋白家族[1],在哺乳動物細胞中廣泛表達。已有研究證實,KMT2家族蛋白通過組蛋白甲基化修飾影響染色質(zhì)重塑,在多種腫瘤的進展中起到重要作用[2]。組蛋白的單甲基化、雙甲基化、三甲基化以及去甲基化可動態(tài)調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。KMT2家族蛋白主要包括SET1A、SET1B、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D,其中KMT2C可與核心蛋白(WDR5、RBBP5、ASH2、UTX、PA1等)構(gòu)成MLR(MLL-TRR)復合體,在基因啟動子或增強子區(qū)域使H3組蛋白4位賴氨酸發(fā)生單甲基化(H3K4me1)[3]。

本文探究了KMT2C在胃癌細胞中的作用及其具體的分子機制,有望為今后新藥的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

胃癌細胞系由本實驗室前期保存并提供;RPMI-1640培養(yǎng)液、Opti-MEM無血清培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Gibco公司;Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;KMT2C、c-Myc、CDK4、H3K4me1抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;GAPDH抗體購于武漢ABclonal生物科技有限公司;大腸埃希菌DH5α感受態(tài)、PCR試劑盒、 DNA凝膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper),qPCR SYBR Green Master Mix(Low ROX Premixed)購于諾唯贊公司(中國);shRNA、PCR引物由奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司合成;CCK-8(cell counting kit-8)試劑購于美國MCE(MedChemExpress)公司;EdU檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物公司;山羊抗鼠IgG綠色Dylight488熒光標記二抗、山羊抗兔IgG紅色Cy3熒光標記二抗購于Abbkine公司(中國);染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試劑盒購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

在TCGA-STAD/RNAseq/STAR/TPM數(shù)據(jù)集中,對KMT2C在胃癌與癌旁之間的表達差異進行在線分析。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法

提取處理后細胞的蛋白質(zhì),BCA法測定蛋白濃度,沸水加熱10 min。恒壓60 V下SDS-PAGE電泳,30 min后恒壓120 V電泳1 h,轉(zhuǎn)膜90 min,用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST清洗10 min,重復清洗3次。一抗4°C孵育過夜,取出膜,用TBST清洗10 min,重復3次,然后進行ECL化學顯色。

1.4 細胞系構(gòu)建

將質(zhì)粒shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2分別與慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,獲得shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2慢病毒上清。向細胞系中加入病毒上清,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。

1.5 克隆形成實驗

分別取shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2組對數(shù)生長期細胞消化后進行細胞計數(shù),每組取400個細胞接種于6孔板,細胞貼壁后更換培養(yǎng)液,間隔3 d更換一次培養(yǎng)液,2周后終止培養(yǎng);棄培養(yǎng)液,用PBS洗3次,4%多聚甲醛室溫固定15 min;棄固定液,用1%結(jié)晶紫染色20 min,用ddH2O緩慢沖洗,待6孔板干燥后拍照計數(shù)細胞克隆。

1.6 CCK-8法檢測胃癌細胞增殖

將shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2組對數(shù)生長期細胞消化后進行細胞計數(shù),稀釋后每組取3000個細胞接種于96孔板中,每組分別設3個復孔。細胞貼壁后更換培養(yǎng)液,加入CCK-8反應物,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,450 nm波長下測定吸光度值(A450nm),按照相同方法分別于24、48、72、96 h后測吸光度值,繪制細胞生長曲線。

1.7 EdU(細胞DNA合成速率測定)檢測

按照試劑盒相應步驟進行。將shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2組對數(shù)生長期細胞消化后進行細胞計數(shù),稀釋后每組取3000個細胞接種于96孔板中,每組分別設3個復孔。細胞貼壁后更換培養(yǎng)液,加入含EdU試劑的培養(yǎng)液,并在培養(yǎng)箱孵育2 h。取出96孔板,棄去培養(yǎng)液,配制EdU檢測試劑,加入96孔板中并孵育30 min。使用DAPI進行細胞核染色10 min。于顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 構(gòu)建皮下移植瘤模型

分別構(gòu)建shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2穩(wěn)轉(zhuǎn)BGC-823胃癌細胞株,并接種于裸鼠皮下,觀察皮下瘤生長情況。

1.9 基因集富集分析(GSEA)

在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE54129,在GSEA軟件中進行富集分析。

1.10 qRT-PCR檢測

棄去細胞培養(yǎng)液,PBS清洗3遍,每107個細胞加入1 mL Trizol后,反復吹打裂解細胞。將Trizol裂解液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中,室溫放置5 min。向1 mL的Trizol裂解液中加入0.2 mL氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫下放置2 min。12000 r/min離心15 min。將上清與異丙醇按1∶1混勻,室溫放置10 min,12000 r/min 4℃離心10 min。棄上清,加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀,12000 r/min 4℃離心10 min。棄上清,自然干燥,肉眼無明顯殘余上清后加入無酶水溶解。按照HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照qPCR SYBR Green Master Mix(Low ROX Premixed)說明書上機。

1.11 免疫熒光檢測

將shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2組的細胞接種于12孔板爬片上,待細胞貼壁后,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定20 min,用1%BSA室溫封閉1 h,一抗以1∶200比例與1%BSA混勻后加入12孔板,覆蓋爬片,4℃浸染過夜;次日,棄一抗,用1%BSA洗3次,熒光二抗(Abbkine)按1∶100與1%BSA混勻加入12孔板并浸沒爬片,室溫染色1 h;棄二抗,用1%BSA洗3次,DAPI染色5 min,取出爬片倒扣至預先滴有熒光淬滅劑的玻片上,置于濕盒封存待檢。

1.12 ChIP檢測

取shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2細胞各約(1～2)×107個細胞根據(jù)Proteintech公司ChIP試劑盒說明書行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗。用甲醛將活細胞中的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)在一起,裂解細胞后用酶切法進行DNA的片段化,添加一抗孵育,捕獲抗體結(jié)合的蛋白DNA復合物并利用磁珠清洗,洗脫DNA,利用磁力架吸附磁珠,轉(zhuǎn)移上清至新管。解交聯(lián)、Proteinase K消化和DNA純化,終止反應。純化DNA用于后續(xù)實驗。

1.13 統(tǒng)計學方法

所有實驗重復3次。使用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,采用t檢驗比較各組間均數(shù)差異,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。通過Kaplan-Meier生存曲線分析患者生存期差異。

2 結(jié)果

2.1 KMT2C在胃癌中高表達

利用TCGA數(shù)據(jù)庫,分析了KMT2C在胃癌中的表達水平,結(jié)果示KMT2C表達水平在胃癌中顯著增高(圖1A)。于華中科技大學同濟醫(yī)院胃腸外科收集臨床胃癌樣本8例,提取樣本分析KMT2C蛋白水平差異,可見在6例樣本中KMT2C呈高表達(圖1B)。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析KMT2C高表達組和KMT2C低表達組胃癌患者的生存期差異,結(jié)果示KMT2C高表達胃癌患者預后較差(圖1C)。

A:TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析胃癌組織KMT2C mRNA表達量;B:Western blot檢測胃癌組織與癌旁組織臨床樣本中KMT2C蛋白表達量,P為癌旁組織,T為胃癌組織;C:Kaplan-Meier分析不同KMT2C表達量的胃癌患者的生存期;*P<0.05圖1 KMT2C在胃癌中的表達情況Fig.1 Expression of KMT2C in gastric cancer

2.2 敲減KMT2C體外抑制胃癌細胞增殖

在BGC-823細胞系中敲減KMT2C(圖2A),Western blot驗證敲減效率后行克隆形成、CCK-8、EdU檢測,結(jié)果示敲減KMT2C后,BGC-823細胞克隆形成數(shù)明顯減少(圖2B);CCK-8結(jié)果顯示敲減KMT2C后細胞活力降低(圖2C);EdU檢測結(jié)果顯示敲減KMT2C后細胞DNA合成速率降低(圖2D)。綜上,敲減KMT2C可抑制胃癌BGC-823細胞系的增殖。

2.3 敲減KMT2C體內(nèi)抑制胃癌細胞增殖

構(gòu)建裸鼠皮下瘤模型,定期監(jiān)測皮下瘤體積。注射后32日取皮下瘤。結(jié)果可見敲減KMT2C的胃癌細胞在體內(nèi)的增殖能力降低(圖3A)。敲減KMT2C的BGC-823細胞移植皮下瘤的體積及重量相較于對照組降低(圖3B、3C)。綜上,我們認為KMT2C在體內(nèi)有促進胃癌細胞增殖的作用。

2.4 KMT2C促癌作用與c-Myc/CDK4通路相關(guān)

利用GSEA對GSE54129胃癌數(shù)據(jù)集進行KMT2C基因集富集分析,結(jié)果示KMT2C與c-Myc信號通路相關(guān)(圖4A)。在BGC-823細胞中敲減KMT2C后檢測c-Myc及其下游CDK4的mRNA水平和蛋白表達量,結(jié)果見敲減KMT2C后c-Myc的蛋白表達量無明顯變化,CDK4的蛋白水平降低(圖4B)。qRT-PCR檢測各組KMT2Cc-MycCDK4的mRNA水平變化,結(jié)果示KMT2C敲減后c-Myc的mRNA水平無明顯改變,CDK4的mRNA水平降低(圖4C)。通過熒光定位分析發(fā)現(xiàn)敲低KMT2C后,核內(nèi)c-Myc定位無明顯變化(圖4D)。故KMT2C不影響c-Myc表達水平及核內(nèi)定位。

A:Western blot驗證敲減效率;B:各組BGC-823細胞克隆形成;C:CCK-8法檢測各組細胞增殖曲線;D:各組的EdU檢測結(jié)果;**P<0.01圖2 敲減KMT2C在體外抑制胃癌細胞BGC-823增殖Fig.2 Knockdown of KMT2C suppresses gastric cancer cells proliferation in vitro

A:各組裸鼠皮下瘤大小測量(n=6);B:皮下瘤生長曲線;C:各組皮下瘤重量;**P<0.01圖3 敲減KMT2C在體內(nèi)抑制胃癌細胞BGC-823增殖Fig.3 Knockdown of KMT2C suppresses gastric cancer cells proliferation in vivo

2.5 KMT2C與c-Myc結(jié)合促進CDK4轉(zhuǎn)錄

KMT2家族可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,并通過H3K4me1、H3K4me2以及H3K4me3改變核小體中組蛋白與DNA空間關(guān)系從而促進或抑制轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]。通過免疫共沉淀驗證KMT2C可與c-Myc核內(nèi)結(jié)合(圖5A、5B)。提取胞核蛋白并檢測敲低KMT2C后H3K4me1蛋白表達量,結(jié)果示敲減KMT2C后,H3K4me1降低(圖5C)。JASPAR網(wǎng)站上查詢c-Myc識別模序(圖5D),預測CDK4的結(jié)合位點(圖5E),ChIP結(jié)果可見敲低KMT2C后,c-Myc與CDK4的啟動子結(jié)合減少(圖5F、5G)。

A:KMT2C基因集富集分析結(jié)果示意圖(NES=168,Nominal P-value=0.0);B:敲減KMT2C后BGC-823細胞中c-Myc、CDK4蛋白表達水平;C:敲低KMT2C后BGC-823細胞中c-Myc、CDK4 mRNA表達水平,**P<0.01;D:免疫熒光結(jié)果示意圖,敲低KMT2C后c-Myc的核內(nèi)定位無明顯改變,標尺=10 μm圖4 KMT2C功能與c-Myc信號通路相關(guān)Fig.4 KMT2C function is related to c-Myc signaling pathway

A:免疫共沉淀示KMT2C與c-Myc結(jié)合;B:免疫熒光共定位示KMT2C與c-Myc胞核內(nèi)共定位,標尺=10 μm;C:KMT2C敲減后H3K4me1水平降低;D:c-Myc識別模序示意圖;E:JASPAR預測c-Myc結(jié)合CDK4啟動子結(jié)合位點結(jié)果;F:核酸凝膠電泳檢測c-Myc與CDK4啟動子結(jié)合減少;G:qRT-PCR檢測c-Myc與CDK4啟動子結(jié)合,**P<0.01圖5 BGC-823細胞中KMT2C與c-Myc結(jié)合促進CDK4轉(zhuǎn)錄Fig.5 KMT2C binds to c-Myc to promote transcription of CDK4 in BGC-823 cells

3 討論

胃癌是全球第5大最常見的癌癥和第3大最常見的癌癥死亡原因,作為一種分子和表型高度異質(zhì)性的疾病,目前研究中的一項重要挑戰(zhàn)是將胃癌發(fā)病機制的分子生物學新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化到有效的治療中[5]。基因突變以及表觀遺傳修飾共同塑造了轉(zhuǎn)錄調(diào)控紊亂的腫瘤細胞[6],其中表觀遺傳修飾(包括DNA、組蛋白的各種修飾)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可忽視的作用。DNA緊密地包繞在組蛋白上共同形成核小體,是染色質(zhì)的主要成分,組蛋白的翻譯后修飾(甲基化、乙?；?、磷酸化等)可改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),從而促進或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[7]。KMT2家族(lysine methyltransferase 2 family)是一個編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的家族,KMT2家族蛋白甲基化組蛋白H3尾部的4位賴氨酸從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[8]。已有文獻報道KMT2C在胰腺導管腺癌[9]、前列腺癌[10]中的促癌作用。然而KMT2C在胃癌中的作用鮮有報道,其作用機制尚未完全闡明。

Myc-CDK4軸是Wnt信號通路的重要組成部分,是腫瘤中最容易發(fā)生異常的途徑之一[11]。CDK4是c-Myc信號傳導的重要下游介質(zhì),在細胞周期的G1/S期起著至關(guān)重要的作用。c-Myc在胃癌中的過度表達可由Wnt途徑激活誘導,其表達又可增強CDK4的表達,從而促進癌細胞的增殖。目前尚未有KMT2C影響c-Myc/CDK4信號通路的相關(guān)報道。

本研究結(jié)合數(shù)據(jù)庫及臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)KMT2C在胃癌組織中高表達,通過GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)KMT2C與c-Myc信號通路相關(guān),進一步說明KMT2C與c-Myc結(jié)合,促進H3K4me1表達,發(fā)揮類似增強子的作用[11],增強CDK4轉(zhuǎn)錄,從而促進胃癌細胞的體內(nèi)外增殖[12]。

我們的研究證明了KMT2C/c-Myc/CDK4信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制,為新藥的研發(fā)提供了新的思路與理論依據(jù)。KMT2C有望成為胃癌的潛在治療靶點[13],即通過小分子抑制劑改變組蛋白甲基化修飾狀態(tài)從而治療腫瘤[14]。同時,KMT2C有望成為胃癌的預后指標之一。