李川, 謝景臣, 趙展慶**

(1.海南西部中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學科, 海南 儋州 571799; 2.海南西部中心醫(yī)院 呼吸內科, 海南 儋州 571799)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)由心臟冠狀動脈氧氣和營養(yǎng)供應不足導致,以心肌細胞不可逆轉的凋亡、急性或持續(xù)性心肌缺血缺氧引起的心肌壞死為特征［1-3］。最近研究表明,一些非編碼RNA(non coding RNAs),如環(huán)狀RNA(circular RNAs, circRNA)或微小RNA(microRNAs, miRNA)可以作為基因調控網絡中的分子,參與AMI發(fā)生和發(fā)展中的多種生物學機制［4-5］。本研究通過篩選高通量基因表達(gene expression omnibus, GEO)數據庫發(fā)現hsa-circ_001653在AMI中表達增強,但是其影響AMI的潛在分子機制仍有待進一步探討。miR-324-5p是miRNAs中一員,有研究顯示其高表達能夠減少心肌細胞凋亡、改善心臟功能、并在AMI中發(fā)揮保護作用［6］。ELAV樣RNA結合蛋白1(ELAV RNA-binding protein 1, ELAVL1)基因也被稱為HuR,其作為一種RNA結合蛋白,能夠對細胞增殖凋亡等生物學行為進行調控,有研究表明ELAVL1能夠通過調控CUGBP1促進心肌細胞凋亡,加重AMI進展［7］。本研究擬探討circRNA_001653對AMI大鼠心肌細胞凋亡的作用及其潛在分子機制,從而為研究AMI的分子靶向治療手段開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 大鼠心肌細胞H9C2購自美國典型菌種保藏中心。

1.1.2主要試劑與儀器 miRNA模擬物由上海吉瑪公司設計并合成;RNeasyMinElute試劑盒(沃森生物)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒及免疫組織化學試劑盒(碧云天生物),RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)試劑盒(吉賽生物),TRIzol試劑盒(美國Thermo Fisher),逆轉錄和SYBRPremixEXTaq試劑盒(日本Takara),放射免疫沉淀法緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒(博士德生物),相關抗體(美國Abcam),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific protease 3, Caspase-3)、Caspase-9活力試劑盒(紀寧實業(yè)),1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride, TTC)溶液(森貝伽生物),腺病毒純化濃縮試劑盒(德國Millipore),螢光素酶報告載體(美國Life Technologies);低氧培養(yǎng)箱(E5019,北京艾克賽侖),倒置熒光顯微鏡(LF200,廣州萊特光電),酶標儀(SpectraMax 190,美谷生物),紫外分光光度計(Alpha-1900Splus,上海譜元),流式細胞儀(FACSCantoⅡ,美國BD)。

1.2 研究方法

1.2.1生物信息分析 從國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數據庫獲取AMI相關芯片信息(GSE160717)并進行分析,差異circRNAs篩選條件為Padj<0.05和|logFC|≥2。通過circinteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)得到circRNA和miRNA的特異性結合位點,在miRDB(http://mirdb.org/index.html)獲取miRNA的下游靶基因,通過注釋可視化和集成發(fā)現數據庫(the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery,DAVID;https://david.ncifcrf.gov/home.jsp.)進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,使用DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org)查詢與AMI相關的基因,借助String 數據庫(https://string-db.org)用于分析蛋白間互作用關系。

1.2.2細胞培養(yǎng)和處理 H9C2細胞置于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1%青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin, P/S)的高糖培養(yǎng)基中,在37 ℃含5%CO2的條件下培養(yǎng)。常氧條件下培養(yǎng)的細胞被設置為Normoxia組;缺氧條件下(1%O2、5%CO2及94%N2)培養(yǎng)的細胞被設置為Hypoxia組,依據缺氧不同時間(12 h、24 h及48 h)將缺氧細胞分為Hypoxia 12 h組、Hypoxia 24 h組、Hypoxia 48 h組。此外,細胞缺氧誘導48 h前轉染相應載體并分為sh-NC組(細胞轉染sh-circ_001653陰性對照載體、缺氧誘導48 h)、sh-circ_001653組(細胞轉染sh-circ_001653載體、缺氧誘導48 h)、circ-NC組(細胞轉染circ_001653陰性對照載體、缺氧誘導48 h)、circ_001653組(細胞轉染circ_001653載體、缺氧誘導48 h)、circ_001653+miR-NC組(細胞轉染circ_001653和miR-NC載體、缺氧誘導48 h)、circ_001653+miR-324-5p mimic組(細胞轉染circ_001653和miR-324-5p載體、缺氧誘導48 h)、miR-NC組(細胞轉染miR-NC載體、缺氧誘導48 h)、miR-324-5p mimic組(細胞轉染miR-324-5p、缺氧誘導48 h)、miR-324-5p mimic+pcDNA3.1組(細胞轉染miR-324-5p mimic和pcDNA3.1、缺氧誘導48 h)、miR-324-5p mimic+ELAVL1組(細胞轉染miR-324-5p mimic和ELAVL1、缺氧誘導48 h),轉染步驟依據LipofectamineTM3000試劑盒說明書完成。

1.2.3實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 收集“1.2.2”項下Normoxia組、Hypoxia 12 h組、Hypoxia 24 h組及Hypoxia 48 h組細胞,用TRIzol試劑盒提取細胞中的總RNA,使用分光光度計測定RNA的濃度和純度;使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成互補DNA(complementary DNA,cDNA),以上述cDNA為模板,分別擴增各個基因及內參片段后用SYBRPremixEXTaq試劑盒進行實時熒光定量PCR實驗,引物序列見表1。設置反應程序為95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 15 s。用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量,miR-324-5p內參為U6、circ_001653和ELAVL1內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)。

表1 RT-qPCR序列

1.2.4Caspase-3及Caspase-9活性檢測 采用Caspase-3、Caspase-9試劑盒檢測各組細胞中Caspase-3及Caspase-9活性。收集“1.2.2”項下Normoxia組、Hypoxia 48 h組、sh-NC組、sh-circ_001653組、circ-NC組、circ_001653組、circ_001653+miR-NC組、circ_001653+miR-324-5p mimic組、miR-NC組、miR-324-5p mimic組、miR-324-5p mimic+pcDNA3.1組、miR-324-5p mimic+ELAVL1組細胞,4 ℃下500 r/min離心2～3 min,收集細胞;使用預冷的PBS洗滌細胞2～3次,取上清;細胞中加預冷的裂解緩沖液100 μL,振蕩離心后置于冰上保存?zhèn)溆谩radford 法進行蛋白定量,取含20～50 μg蛋白的裂解上清10 μL,加入顯色底物10 μL,37 ℃避光反應1～2 h后測定450 nm處吸光度(absorbance,A)值確定Caspase 3和Caspase-9活性程度。

1.2.5細胞凋亡檢測 取“1.2.2”項下Normoxia組、Hypoxia-48 h組、sh-NC組、sh-circ_001653組、circ-NC組、circ_001653組、circ_001653+miR-NC組、circ_001653+miR-324-5p mimic組、miR-NC組、miR-324-5p mimic組、miR-324-5p mimic+pcDNA3.1組、miR-324-5p mimic+ELAVL1組細胞,用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。加適量0.25%胰蛋白酶消化,制成單細胞懸液,4 ℃下1 000 r/min離心5 min;棄上清,PBS洗滌2～3次再次離心,使用Binding buffer 500 μL重懸細胞,添加Annexin V-FITC和Propidium Iodide(PI)染色液各5 μL,混勻后避光孵育20 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6核糖核酸酶R(ribonuclease R, RNase R)試驗 按RNeasyMinElute試劑盒說明書進行操作,收集“1.2.2”項下Hypoxia-48 h組細胞、用TRIzol法提取細胞總RNA。將細胞分為實驗組(RNase R 處理,RNase R+)與對照組(等量的雙蒸餾水,RNase R-),在同一樣本中取RNA 10 μg ,分別加入2組中,37 ℃孵育20 min,RNase R消化后采用RT-qPCR測定濃度。

1.2.7熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)實驗 收集“1.2.2”項下Hypoxia-48 h組細胞,采用FISH試劑盒檢測circ_001653的亞細胞定位,滴預雜交液孵育60 min,去除預雜交液后滴加雜交液(含探針 circ_001653),35 ℃雜交過夜。雜交后檸檬酸鈉(saline sodium citrate, SSC)溶液洗去雜交液,滴加4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染液,室溫避光孵育10 min,PBS 洗滌后滴加抗熒光淬滅封片劑封片,倒置熒光顯微鏡拍照。

1.2.8螢光素酶活性測定 收集“1.2.2”項下Hypoxia-48 h組細胞,分別采用circinteractome和miRDB數據庫預測circ_001653、ELAVL1的3′-非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)與miR-324-5p的特異性結合位點。將含有miR-324-5p結合位點的circ_001653、ELAVL1的 3′-UTR序列克隆到螢光素酶報告載體,將攜帶野生型(wild type,WT)和突變型(mutant type,MUT)circ_001653、ELAVL1的 3′-UTR序列的報告載體分別與miR-324-5p mimic 或miR-324-5p-NC兩兩共轉染至細胞,轉染48 h后對螢光素酶活性進行測定,螢光素酶活性為螢火蟲螢光素酶和海腎熒光素酶的比值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 circ_001653表達

AMI相關芯片GSE160717中包含3個AMI患者樣本和3個正常對照樣本的circRNAs信息,篩選后發(fā)現66個circRNAs在AMI中表達上調,其中circ_001653在AMI患者中的表達較正常對照組顯著上調。之后檢測circ_001653在Hypoxia處理的原代心肌細胞中的表達水平,結果顯示,原代心肌細胞在Hypoxia處理后,circ_001653的表達水平在12 h、24 h、48 h時間點呈時間依賴性升高(P<0.05)。見圖1。

注：A為芯片檢測出的132個差異circRNAs,B為差異表達的circRNAs熱圖(紅色表示上調miRNA,藍色表示下調miRNA),C為H9C2細胞中circ_001653的RT-qPCR檢測結果;(1)與Normoxia組比較,P<0.05。

2.2 Caspase-3、Caspase-9的活力及細胞凋亡

與Normoxia組相比,Hypoxia 48 h組大鼠心肌細胞H9C2細胞凋亡率增加(P<0.05),Caspase-3、Caspase-9活力升高(P<0.05);與sh-NC組相比,sh-circ_001653組細胞凋亡率降低,Caspase-3、Caspase-9活力減弱(P<0.05)。見圖2。

注：A為流式細胞術檢測細胞凋亡率情況,B為細胞凋亡率定量結果,C、D分別為Caspase-3和Caspase-9活力測定;(1)與Normoxia組比較,P<0.05;(2)與sh-NC組比較,P<0.05。

2.3 miR-324-5p與circ_001653的結合關系

RNase確定circ_001653的環(huán)狀結構(圖3A),FISH技術對circ_001653表達進行定位,發(fā)現其主要在胞質中表達(圖3B);為進一步探究circ_001653和miR-324-5p的潛在作用機制,借助靶向關系在線預測網站數據庫得到特異性結合位點(圖3C);雙螢光素酶報告實驗結果顯示(圖3D),相對于circ_001653-WT和miR-NC共轉染組,circ_001653-WT和miR-324-5p mimic共轉染組熒光素酶活性降低(P<0.05)。

注：A為RNase實驗結果,B為FISH實驗結果(紅色表示細胞質,藍色表示細胞核,400×),C為靶向關系預測結果,D為雙螢光素酶分析報告實驗結果;(1)與RNase R-組比較,P<0.05;(2)與miR-NC組比較,P<0.05。

2.4 miR-324-5p表達及circ_001653對缺氧誘導心肌細胞的影響

與Normoxia組比較,Hypoxia處理后的原代心肌細胞中miR-324-5p表達于12 h、24 h 及48 h,呈時間依賴性下降(P<0.05);與circ-NC組相比,circ_001653組細胞凋亡率增加(P<0.05),Caspase-3及Caspase-9活力升高(P<0.05);與circ_001653+miR-NC組相比,circ_001653+miR-324-5p mimic組細胞凋亡率、Caspase-3及Caspase-9活力均下降(P<0.05)。見圖4。

注：A為流式細胞術檢測細胞凋亡情況,B為各組細胞中miR-324-5p的RT-qPCR檢測結果,C為各組細胞凋亡率統(tǒng)計,D為Caspase-3及Caspase-9活力測定;(1)與Normoxia組相比,P<0.05;(2)與circ-NC組比較,P<0.05;(3)與circ_001653+miR-NC組比較,P<0.05。

2.5 ELAVL1與miR-324-5p的靶向關系

miRDB數據庫預測得到264個miR-324-5p的下游靶基因,通過DAVID數據庫進行KEGG富集分析,結果顯示有48個基因顯著富集通路(圖5A);腺苷酸激活蛋白激酶［adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK］信號通路(P=0.016 92,Fold Enrichment=3.95×105)是AMI進展中的一條重要通路,該通路中包括6個基因［6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4,PFKFB4)、人肉毒堿棕櫚?；D移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)、蛋白質磷酸酶2調節(jié)亞基5D(protein phosphatase 2, regulatory subunit 5D,PPP2R5D)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor,IGF1)、ELAV樣RNA結合蛋白1(ELAV like RNA binding protein 1,ELAVL1)及叉頭框蛋白O1(forkhead box O1,FOXO1)］,結合以往文獻分析后、最終將ELAVL1納入本研究,圖5B表明了miR-324-5p與ELAVL1的特異性結合位點,雙螢光素酶報告實驗證實ELAVL1確為miR-324-5p的直接靶點(圖5C)。

注：A為KEGG富集分析結果(顏色由紅色到黃色表示P值由大到小),B為靶向結合序列,C為雙螢光素酶報告實驗結果;(1)與miR-NC組比較,P<0.05。

2.6 ELAVL1和miR-324-5p對缺氧處理心肌細胞的作用

與Normoxia組相比,ELAVL1在Hypoxia呈時間依賴性提高,且在缺氧誘導48 h達到最高(P<0.05);與miR-NC組相比,miR-324-5p mimic組細胞凋亡率、Caspase-3及Caspase-9活力均下降(P<0.05);與miR-324-5p mimic+pcDNA3.1組相比,miR-324-5p mimic+ELAVL1組細胞凋亡率、Caspase-3及Caspase-9活力均升高(P<0.05)。見圖6。

注：A為各組細胞凋亡檢測結果,B為各組細胞ELAVL1的mRNA表達檢測結果,C為各組細胞凋亡率統(tǒng)計結果,D為各組細胞Caspase-3及Caspase-9活性;(1) 與Normoxia組比較,P<0.05;(2) 與miR-NC組比較,P<0.05;(3) 與miR-324-5p mimic+pcDNA3.1組比較,P<0.05。

3 討論

發(fā)生AMI后,梗死邊緣區(qū)的缺血應激可誘導存活心肌細胞凋亡,促進心肌在缺氧等環(huán)境刺激下發(fā)生心室重構和心力衰竭［8-10］,AMI也是影響心血管疾病患者存活率和生活質量的重要因素［11］。研究心肌細胞凋亡和抗凋亡機制,并且在AMI發(fā)生的早期干預心肌細胞凋亡可以顯著改善AMI的預后［12-14］。缺氧是導致AMI的主要危險因素,缺氧會引起心肌細胞代謝紊亂、功能異常,從而引發(fā)心肌細胞損傷和凋亡［15-16］。本研究在體外環(huán)境下構建缺氧處理的心肌細胞模型,探究circ_001653對AMI體外心肌細胞模型凋亡的影響,以期明確其與AMI發(fā)生發(fā)展的密切關系,對防治AMI具有重要意義。本研究結果表明,缺氧誘導的心肌細胞中circ_001653呈高表達,且于48h達到最高,提示其可能在AMI的進展中發(fā)揮作用。此外,敲減心肌細胞中circ_001653的表達,結果顯示心肌細胞凋亡率下降,Caspase-3、Caspase-9的活力降低,這也初步明確circ_001653可能通過調節(jié)缺氧誘導的心肌細胞凋亡等參與了AMI的進程。

隨后本研究通過生物信息學在線預測網站獲取了circ_001653的潛在結合靶點,將miR-324-5p納入研究并在體外驗證了circ_001653與miR-324-5p軸之間的關系。既往研究已表明miR-324-5p在心肌細胞氧化應激和凋亡中起調節(jié)作用,可通過調節(jié)MTFR進而抑制線粒體分裂、細胞凋亡及心肌梗死［17］。本研究同樣發(fā)現在缺氧處理的心肌細胞中miR-324-5p的表達也呈時間依賴性減少,功能實驗進一步證實了circ_001653過表達能夠促進缺氧誘導的心肌細胞的凋亡;加入miR-324-5p后,circ_001653對心肌細胞的作用被部分挽救,提示circ_001653可以通過靶向結合miR-324-5p進而調控心肌細胞的凋亡。

為了更好地了解circ_001653在AMI中的作用,進一步尋找miR-324-5p的下游靶點,通過KEGG富集分析,在富集通路中發(fā)現了AMPK信號通路,AMPK信號通路被證實是影響AMI進展的重要通路［18-19］。因此,選擇對富集在AMPK通路中的基因進行分析,將AMPK信號通路中的基因與AMI的疾病風險基因進行蛋白相互作用分析并且結合以往文獻［7］,最終將ELAVL1納入研究。之后本研究證實了miR-324-5p對ELAVL1有負調控作用,進一步發(fā)現,miR-324-5p在缺氧誘導的心肌細胞凋亡中的抑制作用可以被過表達ELAVL1部分逆轉。

綜上所述,本研究探討了circ_001653在AMI過程中的作用,結果表明circ_001653可通過吸附miR-324-5p,上調ELAVL1的表達,促進心肌細胞凋亡,本研究從體外實驗的角度為AMI的發(fā)病機制與治療手段的探索提供了新的線索。