張燁君, 李倩, 婁展, 聶曉慧, 宋婕

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院 神經內三科, 河北 張家口 075000)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種運動能力異常的神經系統(tǒng)疾病,已成為第二常見的慢性和全身性神經退行性疾病,僅次于阿爾茨海默?。?］。PD的主要特征是黑質多巴胺能神經元的丟失,從而導致神經元信號失調,最終導致運動障礙［2］。PD的發(fā)病機理尚不完全清楚,但普遍認為與多巴胺能神經元喪失、氧化應激、線粒體功能障礙及蛋白質聚集有關［3-4］。微小RNA(microRNA,miRNA)是高度保守的小型非編碼RNA,miRNA在多巴胺能神經元的功能以及神經退行性疾病的病理生理中有重要的作用［5-6］。miRNA-299-5p(miR-299-5p)位于染色體14q32.31上的印跡Dlk1-Dio3區(qū),研究表明miR-299-5p可抑制神經元自噬和細胞凋亡、改善阿爾茨海默病小鼠的認知能力［7］;Tolosa等［8］研究表明miR-299-5p在PD患者中的表達下調,但miR-299-5p對PD的作用機制尚不清楚。本研究主要探討miR-299-5p通過靶向特異性蛋白1(specificity protein 1,SP1)對PD模型細胞凋亡的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物及細胞來源 10周齡雄性C57BL/6小鼠,體質量20～25 g,購自河北省實驗動物中心［許可證號SCXK(冀)2018-004］,于濕度為(50±10)%、溫度為(22±3)℃、12 h/12 h的明暗環(huán)境中單獨飼養(yǎng),自由飲食;研究獲得醫(yī)院動物護理和使用委員會批準(IACUC20200320008)。人神經母細胞瘤細胞系 SH-SY5Y購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,置于10% 胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 (Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)、 37 ℃及5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 miR-299-5p過表達腺病毒載體(adenovirus miR-299-5p,Ad-miR-299-5p)和SP1過表達腺病毒載體(adenovirus-SP1,Ad-SP1)及相對應的陰性對照載體(adenovirus negative control,Ad-NC),miR-299-5p模擬物(miR-299-5p mimic)及其陰性對照(miR-negative control,miR-NC),SP1表達質粒(pcDNA-SP1,pc-SP1)及其陰性對照質粒(pcDNA-negative control,pc-NC),均由北京奧科生物科技有限公司設計并合成;1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-hydrochloride,MPTP;純度≥98%,上海聯(lián)碩生物科技有限公司),1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+;純度≥99%,北京謹明生物科技有限公司);末端脫氧核苷酸轉移酶-生物素缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-biotin nick end-labeling,TUNEL)試劑盒(深圳市子科生物科技有限公司),二辛寧可酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司);所有抗體均購自上海艾博抗生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1造模前處理 46只C57BL/6小鼠使用異氟烷深度麻醉后固定在小鼠腦立體定位儀上,暴露顱骨表面。按照圖譜定位右側側腦室(前囟-2 mm,中線旁開2 mm,深 3 mm)、并埋管。造模前2 d,使用5 μL Hamilton 微量注射器(33 號針頭)進行注射,40只小鼠右側側腦室注射20 nmol/L腺病毒載體量,6只作為對照組小鼠注射等體積人工腦脊液。

1.2.2造模及分組 取6只C57BL/6小鼠腹腔注射0.9%無菌生理鹽水作為對照組,另取40只C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP 30 mg/kg,1次/d,連續(xù)7天［9］;最后1次MPTP注射后第0、1、3、5及7天隨機選取8只小鼠斷頭處死,切除腹側中腦,儲存于-80 ℃供后續(xù)PD小鼠中腦組織miR-299-5p和SP1的表達量檢測實驗 。另取42只C57BL/6小鼠隨機均分為對照組、PD組、PD+Ad-NC組、PD+Ad-miR-299-5p組、PD+Ad-SP1組、PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC組及PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1組,除對照組小鼠腹腔注射0.9%無菌生理鹽水外,其余組小鼠腹腔注射MPTP制作PD模型;造模完成后,斷頭處死小鼠取中腦,每組3只小鼠中腦用于分子生物學分析、另3只小鼠中腦固定于4%多聚甲醛溶液供后續(xù)實驗。

1.2.3細胞分組及轉染 SH-SY5Y 細胞用 0.25、0.50 或 1.00 mmol/L MPP+處理24 h 建立體外 PD 細胞模型,取對數期生長的SH-SY5Y細胞隨機分為空白組、MPP+組、MPP++mimic-NC組、MPP++miR-299-5p mimic組、MPP++pc-NC組、MPP++pc-SP1組、MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC組及MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1組,利用Lipofectamine 2000轉染試劑盒按照分組將對應質粒轉入SH-SY5Y細胞,0.50 mmol/L MPP+溶液處理24 h。

1.2.4小鼠中腦組織及 SH-SY5Y 細胞中miR-299-5p和SP1 RNA的表達 取“1.2.2”項下MPTP注射后第0、1、3、5及7天和對照組、PD組、PD+Ad-NC組、PD+Ad-miR-299-5p組小鼠中腦組織及“1.2.3”項下 0.50 mmol/L MPP+處理24 h的空白組、MPP+組、MPP++mimic-NC組及MPP++ miR-299-5p mimic組SH-SY5Y細胞,用 TRIzol 試劑提取各組小鼠中腦組織和SH-SY5Y 細胞的總 RNA,使用 SMA 400 UV檢測分離 RNA 的濃度和純度;使用逆轉錄系統(tǒng)試劑盒從 RNA 樣品中合成cDNA。SP1和miR-299-5p的實時 PCR 分別使用標準的 SYBR Green PCR 試劑盒和 TaqMan miRNA 檢測在 CFX96 實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)系統(tǒng)上進行,以GAPDH或U6為內參,通過 2-ΔΔCt方法計算;定量 PCR 的反應條件為95 ℃ 10 min,95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s 循環(huán) 45 次;miR-299-5p上、下游引物序列為5′- GACCAAAGTGCCTCCCTTTA-3′和5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′,U6上、下游引物序列為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,SP1上、下游引物序列為5′- TGGTGGGCAGTATGTTGT-3′和5′-GCTATTGGCATTGGTGAA-3′,GAPDH上、下游引物序列為5′-TGCCATCACCATCTTCCA-3′和5′- CATCACGCCACAGTTTCC-3′。

1.2.5小鼠中腦組織中的細胞凋亡 取“1.2.2”項下對照組、PD組、PD+Ad-NC組、PD+Ad-miR-299-5p組、PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC組及PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1組小鼠中腦組織,4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋并切片及TUNEL染色,每張切片隨機選取5 個不交叉重復的視野,觀察細胞核中有棕黃色顆粒的凋亡細胞,計算神經細胞凋亡率［細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%］。

1.2.6SH-SY5Y細胞凋亡率 取“1.2.3”項下空白組、MPP+組、MPP++mimic-NC組、MPP++miR-299-5p mimic組、MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC組及MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1組的對數生長期細胞,2 500 r/min離心5 min,膜聯(lián)蛋白V緩沖液重懸;加 FITC標記的膜聯(lián)蛋白V和碘化啶5 μL,避光孵育15 min,采用流式細胞儀BD FACS Diva軟件V6.1.3進行分析細胞凋亡率。

1.2.7活化胱天蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、SP1、PTEN、p-AKT/t-AKT及p-mTOR/mTOR的表達 取“1.2.2”項下對照組、PD組、PD+Ad-miR-299-5p組、PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1組小鼠中腦組織和對數生長期的空白組、MPP+組、MPP++miR-299-5p mimic組、MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1組的SH-SY5Y細胞,使用NP-40裂解緩沖液提取小鼠中腦或SH-SY5Y細胞的總蛋白樣品,用Bradford蛋白測定試劑盒測定蛋白樣品的濃度。蛋白質樣品用10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉至聚偏二氟乙烯膜;5% 脫脂乳室溫封閉1 h,兔來源的單克隆一抗(Cleaved Caspase-3 1∶1 000、SP1 1∶800、PTEN 1∶1 000、p-AKT 1∶1 500、t-AKT 1∶1 500、p-mTOR 1∶1 000及mTOR 1∶1 000)于4 ℃過夜;與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二級單克隆抗體(1∶2 000)于37 ℃下孵育1 h,用電化學發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)成像,FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶。以GAPDH為內參,使用Quantity One軟件進行分析目標蛋白質的相對表達水平。

1.2.8雙螢光素酶報告檢測靶向關系 收集生長至對數期的SH-SY5Y細胞,接種于24孔板中,37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;1 μg PGL3- SP1-WT(SP1野生型)或PGL3- SP1-MUT(SP1突變型)及miR-NC或miR-299-5p mimic和PRL-CMV質粒共轉染入SH-SY5Y細胞,轉染48 h,裂解15 min,雙螢光素酶檢測系統(tǒng)測量螢光素酶的相對活性［螢光素酶的相對活性(R/F)=螢火蟲螢光素酶活性/腎螢光素酶活性］。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-299-5p和SP1的表達

qRT-PCR檢測結果顯示,與對照組相比,腹腔注射MPTP后的第0、1、3、5及7 d PD小鼠中腦組織中miR-299-5p表達下調,SP1表達上調(P<0.01);體外實驗結果顯示,與空白組相比,0.25、0.50、0.75及1.00 mmol/L MPP+組SH-SY5Y細胞中miR-299-5p表達下調,SP1表達上調(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組PD小鼠中腦組織和SH-SY5Y細胞中miR-299-5p和SP1的表達

2.2 細胞凋亡、miR-299-5p及Cleaved Caspase-3表達

小鼠中腦組織中,PD組miR-299-5p表達較對照組下調(P<0.01),PD+Ad-miR-299-5p組miR-299-5p表達較PD組上調(P<0.01),PD組細胞凋亡、Cleaved Caspase-3表達較對照組增加(P<0.01),PD+Ad-miR-299-5p組細胞凋亡、Cleaved Caspase-3表達較PD組減少(P<0.01,圖1和圖2);SH-SY5Y細胞中,MPP+組miR-299-5p表達較空白組下調(P<0.01),MPP++miR-299-5p mimic組細胞miR-299-5p表達較MPP+組上調(P<0.01),MPP+組細胞凋亡、Cleaved Caspase-3表達較空白組增加(P<0.01),MPP++miR-299-5p mimic組細胞凋亡、Cleaved Caspase-3表達較MPP+組減少(P<0.01);差異均有統(tǒng)計學意義(見圖3和圖4)。

注：A為TUNEL檢測小鼠中腦組織細胞凋亡 (TUNEL染色,×200),B為各組細胞凋亡率統(tǒng)計結果,C為qRT-PCR檢測miR-299-5p相對表達;(1)與對照組比較,P<0.01;(2)與PD組比較,P<0.01。

注：A為Western blot檢測Cleaved Caspase-3的表達,B為Cleaved Caspase-3相對表達量;(1)與對照組比較,P<0.01;(2)與PD組比較,P<0.01。

注：A為流式細胞數檢測細胞凋亡,B為各組細胞凋亡率統(tǒng)計,C為qRT-PCR檢測miR-299-5p相對表達;(1)與空白組比較,P<0.01;(2)與MPP+組比較,P<0.01。

注：A為Western blot檢測Cleaved Caspase-3的表達,B為Cleaved Caspase-3相對表達量;(1)與空白組比較,P<0.01;(2)與MPP+組比較,P<0.01。

2.3 miR-299-5p和SP1的靶向關系

Targetscan軟件預測結果表明,miR-299-5p與SP1具有靶向關系,在3′UTR區(qū)存在結合位點;雙螢光素酶報告實驗結果顯示,miR-299-5p mimic與PGL3- SP1-WT共轉染明顯降低了螢光素酶活性(P<0.01);PD+Ad-SP1組小鼠中腦組織中SP1蛋白表達較PD+Ad-NC組明顯上調(P<0.01),PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1組則較PD+Ad-SP1組明顯下調(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義;MPP++pc-SP1組SH-SY5Y細胞中SP1蛋白表達較MPP++pc-NC組明顯上調(P<0.01),MPP++ miR-299-5p mimic+pc-SP1組則較MPP++pc-SP1組明顯下調(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義。見圖5。

注：A為miR-299-5p與SP1 3′UTR區(qū)的結合位點,B為熒光素酶活性,C為Western blot檢測小鼠中腦組織中SP1蛋白表達,D為各組小鼠中腦組織中SP1蛋白相對表達量,E為Western blot檢測SH-SY5Y細胞中SP1蛋白表達,F為各組SH-SY5Y細胞中SP1蛋白相對表達量;(1)與mimic-NC組比較,P<0.01;(2)與PD+Ad-NC組比較,P<0.01; (3) 與PD+Ad-SP1組比較,P<0.01;(4)與MPP++pc-NC組比較,P<0.01; (5) 與MPP++pc-SP1組比較,P<0.01。

2.4 SP1過表達對細胞凋亡和 Cleaved Caspase-3表達的影響

PD+miR-299-5p+Ad-SP1組小鼠中腦組織中細胞凋亡、Cleaved Caspase-3表達較PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC組增加(P<0.01,圖6);MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1組SH-SY5Y細胞凋亡、Cleaved Caspase-3表達較MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC組增加(P<0.01,圖7)。

注：A為TUNEL檢測小鼠中腦組織細胞凋亡(TUNEL染色,×200),B為各組細胞凋亡率統(tǒng)計結果,C為Western blot檢測小鼠中腦組織中Cleaved Caspase-3的表達,D為Cleaved Caspase-3相對表達量;(1)與PD+Ad-miR-299-5p+Ad-NC組比較,P<0.01。

注：A為流式細胞術檢測細胞凋亡,B為各組細胞凋亡率統(tǒng)計,C為Western blot檢測的表達Cleaved Caspase-3,D為Cleaved Caspase-3相對表達量;(1)與MPP++miR-299-5p mimic+pc-NC組比較,P<0.01。

2.5 PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表達

小鼠中腦組織結果顯示(圖8):與對照組相比,PD組小鼠中腦中PTEN表達上調(P<0.05),p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平下調(P<0.05);與PD組相比,PD+Ad-miR-299-5p組小鼠中腦PTEN表達下調(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平上調(P<0.05);與PD+Ad-miR-299-5p組相比,PD+Ad-miR-299-5p+Ad-SP1組小鼠中腦PTEN表達上調(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平下調(P<0.05)。 SH-SY5Y細胞結果顯示(圖9):與空白組相比,MPP+組PTEN表達上調(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平下調(P<0.05);與MPP+組相比,MPP++miR-299-5p mimic組PTEN表達下調(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平上調(P<0.05);與MPP++ miR-299-5p mimic組相比,MPP++miR-299-5p mimic+pc-SP1組PTEN表達上調(P<0.05)、p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平下調(P<0.05)。

注：A為Western blot檢測各組小鼠中腦組織中PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表達,B為PTEN/AKT/mTOR通路蛋白相對表達量;(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與PD組比較,P<0.05;(3)與PD+Ad-miR-299-5p組比較,P<0.05。

注：A為Western blot檢測各組SH-SY5Y細胞中PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表達,B為PTEN/AKT/mTOR通路蛋白相對表達量;(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與MPP+組比較,P<0.05;(3)與MPP+ +miR-299-5p mimic組比較,P<0.05。

3 討論

PD是第二常見的神經退行性疾病,其特點是進行性運動遲緩、震顫、僵硬及姿勢不穩(wěn)［10］。中腦黑質多巴胺能神經元的丟失和死亡被認為是PD主要運動癥狀的主要原因［11］。MPTP具有很高的脂溶性和進入腦內的能力,可以被位于膠質細胞外膜的單胺氧化酶B催化產生MPP+［12］。 MPP+是線粒體氧化呼吸鏈復合物Ⅰ的特異性抑制劑,可降低ATP的生成,誘導多巴胺能神經元(dopaminergic neuron,DA)凋亡［13-14］。 因此,MPTP和MPP作為一種典型的神經毒素,在體內外建立PD模型已有大量研究。許多miRNA參與如PD等神經退行性疾病中各種生物學和病理學過程的調節(jié),如PD患者體細胞和DA中miR-9-5p、miR-30、miR-29、let-7、miR-485、miR-26及miR-299-5p表達異常［8,15-16］。本研究采用MPTP誘導PD小鼠,MPP+誘導SH-SY5Y細胞PD模型,研究發(fā)現在體內外PD模型中miR-299-5p表達下調,SP1表達上調,細胞凋亡率增加,Cleaved Caspase-3表達上調;miR-299-5p過表達抑制MPTP誘導的PD小鼠模型中腦和MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡,并下調Cleaved Caspase-3的表達。

miRNA通過與靶基因的3'-UTR結合,通過影響基因mRNA的翻譯和循環(huán)而抑制蛋白質編碼,參與包括PD在內的多種疾病的發(fā)病機制［17］。SP1是特異性蛋白/Kruppel樣因子家族的成員,有助于調節(jié)細胞生長和凋亡［18］。已有研究表明,miR-375上調可通過抑制SP1改善PD多巴胺能神經元的損傷,減輕氧化應激和炎癥反應［19］;miR-29c在PD模型中通過靶向SP1在體內和體外減輕炎癥和細胞凋亡［20］。本研究表明,miR-299-5p靶向下調SP1,SP1過表達逆轉miR-299-5p對MPTP誘導的PD小鼠中腦和MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡、Cleaved Caspase-3的調節(jié)作用,說明miR-299-5p通過靶向下調SP1抑制MPTP誘導的PD小鼠模型中腦和MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡,并下調Cleaved Caspase-3的表達。

PTEN/AKT/mTOR通路在調控細胞分化、存活及凋亡等過程中具有重要的作用,適當調節(jié)該通路可對抗神經元凋亡,改變PD等神經退行性疾病發(fā)展［21-22］;PTEN是活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生和神經元死亡的重要介質,可成為神經退行性疾病的潛在治療靶點［22］;PTEN通過影響AKT/mTOR信號通路參與PD過程,如miR-181b通過靶向PTEN/AKT/mTOR信號通路調控PD模型中的自噬［23］;miR-410通過抑制PTEN/AKT/mTOR信號通路,在6-羥多巴胺誘導的PD細胞模型中發(fā)揮神經保護作用［24］;SOS1內含子轉錄物1(SOS1 intronic transcript 1,SOS-IT1)通過調節(jié)miR-124-3p/PTEN/AKT/mTOR通路參與MPP+誘導的神經元損傷［25］。本研究結果顯示,MPTP誘導的PD小鼠中腦組織和MPP+處理的SH-SY5SY細胞中PTEN蛋白的表達均明顯增加,p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平下調;過表達miR-299-5p使PD模型小鼠和MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中PTEN表達下調,p-AKT/t-AKT和p-mTOR/t-mTOR表達水平上調;過表達SP1可逆轉miR-299-5p對MPTP誘導的PD模型小鼠中腦和MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中PTEN/AKT/mTOR通路蛋白的表達調控作用。

綜上所述,miR-299-5p 通過靶向SP1對MPTP誘導的PD小鼠中腦組織和MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡發(fā)揮抑制作用,這與PTEN/AKT/mTOR通路有關,因此提示miR-299-5p和SP1可作為治療PD的有效靶標。