李雨, 王杰, 陳銘勰, 艾麗霞, 張耀文, 何子晗, 吳遵秋*, 李蓉*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種發(fā)病率較高的慢性自身免疫性疾病,基本病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎癥、滑膜組織過度增生及血管翳形成,并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［1-3］。治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物、生物制劑等,但存在不良反應(yīng)較多或價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)［4-6］,所以新型藥物的研發(fā)備受重視,辣椒素等中藥有效單體成分已成為近年來研究的新熱點(diǎn)［7］。辣椒素(capsaicin,CAP)是辣椒中最主要的生物活性成分［8-9］,具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化等藥理作用［10］,可作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑［11］,且有研究證明P38MAPK信號(hào)通路與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥細(xì)胞激活、滑膜異常增生等病理過程密切相關(guān)［12］,被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)和共同通路,目前未見CAP通過P38MAPK信號(hào)通路治療RA炎癥的報(bào)道,因此本研究建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠模型,基于P38MAPK信號(hào)通路探究CAP對(duì) CIA 模型大鼠的抗炎作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供［SYXF(黔)2018-0001］。

1.1.2主要試劑與儀器 辣椒素(CATO公司),不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant,IFA,美國Sigma),牛Ⅱ型膠原蛋白(美國Chondrex),大鼠IL-17 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(索萊寶科技有限公司),β-actin、p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13、Casepase-3抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(華安生物科技公司);水平電泳槽(DYY-DI 31D,北京六一儀器廠),冷凍高速離心機(jī)(美國thermo公司),高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠),超凈工作臺(tái)(吳江市偉峰凈化設(shè)備有限公司),Quanity One凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司),DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠),酶標(biāo)儀(美國 BioTek),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI)。

1.2 研究方法

1.2.1動(dòng)物分組 48只雄性SD大鼠,隨機(jī)分成空白組(normal,Nor組)、模型組(model,Mod組)、雷公藤治療組(tripterygium wilfordii,GTW組)及CAP高(3 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低劑量(1 mg/kg)組,每組8只。

1.2.2CIA大鼠模型的建立 將牛Ⅱ型膠原蛋白與IFA 按1∶1充分乳化,40只大鼠尾根部皮下注射0.2 mL上述乳劑進(jìn)行初次免疫,1周后于大鼠足跖部皮下注射0.1 mL上述乳劑加強(qiáng)免疫［13-14］;Nor組大鼠采用等體積生理鹽水代替。加強(qiáng)免疫1周后,通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評(píng)分判定造模情況。

1.2.3給藥 造模2周后,CAP高、中、低劑量組分別給予3 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg的CAP溶液灌胃,GTW組給予40 mg/kg雷公藤溶液灌胃,Nor組及Mod組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)給藥3周［15］。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1大鼠足腫脹度及AI測定 于造模前1 d至灌胃給藥3周后,每周測量1次大鼠足容積,測量方法為:使用導(dǎo)管連接同等大小兩個(gè)注射器,右側(cè)注射器使用馬克筆標(biāo)注并加水至標(biāo)注處,以大鼠后足踝關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)折部位處為界限并標(biāo)記,將大鼠足爪浸入至左側(cè)注射器,抽取右側(cè)注射器上升的水至標(biāo)注處,讀取抽取的水體積數(shù)即為大鼠的后側(cè)足容積［16］;并于灌胃給藥前1 d至灌胃給藥3周后,每周進(jìn)行1次大鼠右后足AI評(píng)分,總分為4分,AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1［17］。

表1 AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2大鼠滑膜組織學(xué)特征 灌胃給藥3周后,將各組大鼠的膝關(guān)節(jié)處滑膜組織取出,使用10%中性甲醛固定,15%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)脫鈣,梯度乙醇及二甲苯脫水透明,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察滑膜組織學(xué)特征。

1.3.3大鼠血清IL-17含量 灌胃給藥3周后,將大鼠心臟取出的全血室溫靜置20 min,3 000 r/min離心15min后取血清,按照測試試劑盒的說明書,采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定大鼠血清樣品的IL-17含量,在450 nm波長下采用酶標(biāo)儀測定其吸光度值,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本濃度。

1.3.4大鼠滑膜組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3 mRNA表達(dá) 灌胃給藥3周后,取大鼠滑膜組織加氯仿、振蕩、靜置,離心取上清后加異丙醇、靜置,離心棄上清后加75%乙醇、洗滌沉淀、棄上清,晾干、加入DEPC 水溶解后得到RNA樣品;取RNA樣品水溶液1 μL于超微量紫外分光光度計(jì)上測A 260/A 280值,測定后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR,qPCR)檢測滑膜組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3 mRNA表達(dá)。qPCR條件為:預(yù)變性95 ℃ 30 s;循環(huán)反應(yīng),95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次;溶解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。用2-ΔΔCt計(jì)算法處理數(shù)據(jù)。引物序列見表2。

表2 RT-PCR引物序列

1.3.5大鼠滑膜組織中p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13和Caspase-3蛋白表達(dá) 灌胃給藥3周后,取出大鼠滑膜組織,加入放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、苯甲基碘酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑進(jìn)行研磨,提取出蛋白質(zhì),采用BCA法測量提取的蛋白質(zhì)濃度后,制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶封閉2 h,分別加入一抗β-actin抗體、p-MKK3抗體、p-P38MAPK抗體、MMP-13抗體、Caspase-3抗體(1∶1 000),4 ℃過夜,洗膜,二抗(1∶10 000)孵育2 h,洗膜,曝光顯影,使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠足腫脹度

與Nor組相比,Mod組大鼠足腫度增大(P<0.001)。與Mod組相比,灌胃3周后GTW組大鼠足腫度明顯減小(P<0.001),CAP高劑量組、中劑量組足腫度減小(P<0.01),CAP低劑量組足腫度有所減小(P<0.05);CAP 高劑量組與GTW組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 大鼠足腫度

2.2 大鼠右后足AI評(píng)分

與Nor組相比,Mod組大鼠AI評(píng)分顯著升高(P<0.001)。與Mod組相比,灌胃3周后各給藥組大鼠AI評(píng)分均降低,且CAP 高劑量組、GTW 組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。見表4。

表4 大鼠右后足AI評(píng)分

2.3 大鼠滑膜組織學(xué)特征

Nor組大鼠未見成簇的滑膜細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤及血管翳形成;與Nor組相比,Mod組大鼠滑膜組織有明顯的炎性細(xì)胞浸潤、大量成纖維細(xì)胞聚集和血管增生,部分區(qū)域軟骨陷窩基本消失。與Mod組相比,GTW組大鼠滑膜組織有少量炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞聚集及滑膜組織輕度充血;CAP 低劑量組炎性細(xì)胞浸潤有所改善,軟骨組織中度增生,部分軟骨細(xì)胞腫脹壞死;CAP 中劑量組滑膜襯里下層大量纖維組織增生,且出現(xiàn)由軟骨破壞導(dǎo)致的關(guān)節(jié)翳形成,疑似個(gè)體差異;CAP 高劑量組關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織充血明顯減輕,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤,也未見成纖維細(xì)胞成簇及分布密度改變。見圖1。

注：A為CAP高劑量組;B為CAP中劑量組;C為CAP低劑量組;D為Mod組;E為GTW組,F為Nor組。

2.4 大鼠血清IL-17含量

與Nor組相比,Mod組大鼠血清中IL-17含量明顯升高(P<0.01)。與Mod組相比,CAP高劑量組和GTW組血清中IL-17含量顯著降低(P<0.01)、CAP 中劑量組血清中IL-17含量降低(P<0.05);而CAP低劑量組與Mod組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 大鼠血清IL-17含量

2.5 大鼠滑膜組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3 mRNA的表達(dá)

與Nor組相比,Mod組大鼠MKK3、P38MAPK、MMP-13 mRNA表達(dá)升高(P<0.01),Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。與Mod組相比,CAP高劑量組和GTW組MKK3、P38MAPK、MMP-13mRNA表達(dá)降低(P<0.05),Caspase-3 mRNA表達(dá)升高(P<0.01);CAP中、低劑量組MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3mRNA表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見圖2。

注：(1)與Nor組比較,P<0.05;(2)與Mod組比較,P<0.05;(3)與GTW組比較,P<0.05。

2.6 大鼠滑膜組織中p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13和Caspase-3蛋白表達(dá)

與Nor組相比,Mod組大鼠p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13蛋白表達(dá)升高(P<0.01),Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。與Mod組相比,CAP高劑量組和GTW組大鼠p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13蛋白表達(dá)降低(P<0.01),Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.01);CAP 中、低劑量組p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13和Caspase-3蛋白表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：(1)與Nor組比較,P<0.05;(2)與Mod組比較,P<0.05;(3)與GTW組比較,P<0.05。

3 討論

RA是一種以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病,病理變化以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主［18-19］。本研究通過牛Ⅱ型膠原與IFA造模后,造模組與Nor組大鼠相比,造模組大鼠后踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹、畸形,AI評(píng)分明顯升高,提示造模成功。經(jīng)藥物治療3周后,病理切片可看出Mod組大鼠大量炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞聚集;而CAP 高劑量組和GTW組病理變化明顯減輕,僅見少量炎性細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞聚集,提示CAP在緩解RA炎癥方面有良好的作用。

已有研究證明RA可導(dǎo)致P38MAPK信號(hào)通路異常激活,而異常激活的P38MAPK信號(hào)通路又進(jìn)一步加重RA的炎性反應(yīng)［20-21］。P38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中控制RA炎性反應(yīng)最重要的成員;MKK3是P38MAPK活化所必須的上游因子,過量磷酸化的MKK3可加重RA滑膜炎癥;MMP-13是P38MAPK的重要下游因子,活化的P38MAPK可通過上調(diào)MMP-13的表達(dá)導(dǎo)致Ⅱ型膠原進(jìn)行性降解、促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生［22-23］;此外,被激活的P38MAPK還可上調(diào)介導(dǎo)RA炎癥的促炎因子IL-17表達(dá)［24］,下調(diào)促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞凋亡的促凋亡因子Caspase-3表達(dá)［25］。綜上可知,可通過抑制P38MAPK信號(hào)通路的活化改善RA的炎性反應(yīng)。

本研究通過檢測大鼠滑膜關(guān)節(jié)組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13、Caspase-3 mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)量變化和血清中IL-17含量變化,探究CAP對(duì)RA的抗炎作用機(jī)制。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Mod組IL-17含量較Nor組升高,經(jīng)CAP治療后,各組大鼠血清IL-17含量降低,且CAP 高劑量組與GTW組IL-17含量相近,提示CAP治療RA的作用可能與其抑制促炎因子IL-17表達(dá)有關(guān)。PCR和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Nor組相比,Mod組MKK3、P38MAPK、MMP-13表達(dá)升高,Caspase-3表達(dá)降低;與Mod組相比,CAP 高劑量組和GTW組MKK3、P38MAPK、MMP-13表達(dá)降低,Caspase-3表達(dá)升高,CAP 中、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示CAP可能抑制了P38MAPK信號(hào)通路的活化,且CAP 高劑量組與GTW組療效相近。

綜上所述,MKK3/P38MAPK/MMP-13信號(hào)通路、RA與CAP三者密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明,CAP對(duì)RA有良好的抗炎作用,揭示其可能機(jī)制為抑制MKK3/P38MAPK/MMP-13信號(hào)通路的活化,減少炎癥因子IL-17的釋放,解除對(duì)促凋亡因子Caspase-3的抑制,從而達(dá)到改善RA的炎癥浸潤及骨破壞的目的?；诖搜芯?CAP可能成為雷公藤的替代療法,但本研究結(jié)果僅僅是初步提示,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可探究CAP作用于RA的其他分子機(jī)制,有利于進(jìn)一步開發(fā)CAP的藥用價(jià)值,同時(shí)也為臨床上CAP治療RA提供理論依據(jù)。