周正龍, 胡俞成, 韓潤(rùn)敏, 彭瀚, 楊華, 向欣*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科, 貴州 貴陽 550004; 2.濟(jì)源市中醫(yī)院 神經(jīng)外科, 河南 濟(jì)源 459000)

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是較為常見的一種急性腦血管疾病,具有較高的臨床病發(fā)率及致殘致死率［1-2］。ACI起病急、治療時(shí)間窗短,關(guān)鍵在于盡早開通閉塞血管以使缺血腦區(qū)獲得有效灌注［3-5］。血紅蛋白氧載體(hemoglobin oxygen carrier,HBOC)是運(yùn)輸和傳遞氧分子的小分子物質(zhì),具有恢復(fù)缺血組織供氧的能力,為缺血組織供應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)氧橋,以增加缺血腦組織的氧供,對(duì)于缺血性腦血管疾病預(yù)后的改善具有顯著意義［6-8］。依達(dá)拉奉(edaravone,EDA)是一種常用于ACI的自由基清除劑,其分子質(zhì)量低、容易穿透血腦屏障,具有消除神經(jīng)細(xì)胞水腫、促進(jìn)炎癥吸收、減輕炎性反應(yīng)等神經(jīng)保護(hù)作用的能力［9-11］。有研究發(fā)現(xiàn),聯(lián)合用藥能更好地應(yīng)對(duì)ACI腦缺血后的級(jí)聯(lián)反應(yīng),是ACI治療的研究熱點(diǎn)［12-14］。推測(cè)在HBOC與EDA聯(lián)合治療ACI的過程中,可能會(huì)表現(xiàn)出較單一藥物治療方案更明顯的協(xié)同保護(hù)作用,其涉及的保護(hù)機(jī)制也可能會(huì)更加多元化。因此,本研究結(jié)合HBOC與EDA的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物學(xué)驗(yàn)證,探討二者聯(lián)合治療對(duì)ACI的神經(jīng)保護(hù)作用及可能機(jī)制,為ACI灌注治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來源 清潔級(jí)雄性成年SD大鼠120只,8～12周齡,體質(zhì)量250～300 g,由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［SYXK(黔)2018-0001］,研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(1600286)。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水,實(shí)驗(yàn)室溫度21～23 ℃,濕度40%～60%。

1.1.2主要儀器與試劑 微量注射泵購(gòu)自宿州百意醫(yī)療器械有限公司,生物組織自動(dòng)組織脫水機(jī)購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司,流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司,SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司,一步法快速Western blot試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;HBOC-201購(gòu)自北京潤(rùn)方生物醫(yī)藥研究有限公司,EDA注射液購(gòu)自南京先聲東元制藥有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1網(wǎng)絡(luò)藥理分析數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/),Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/),OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/),Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/),David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/),STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/),Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/ venny/),Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// www.uniprot.org/),Cytoscape3.9.1軟件,R4.2.1軟件等。

1.2.2藥物及疾病靶點(diǎn)篩選 在NCBI的PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索HBOC及EDA的基本信息,使用PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶點(diǎn),經(jīng)uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)名稱矯正統(tǒng)一、去除重復(fù)靶點(diǎn),分別獲得HBOC及EDA對(duì)應(yīng)靶點(diǎn);使用OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“acute cerebral infarction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,去除重復(fù)靶點(diǎn)后獲得ACI對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2.3共同靶點(diǎn)的篩選及“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)上輸入藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn),將獲得的HBOC、EDA和ACI的靶點(diǎn)相交,繪制維恩圖提取共同靶點(diǎn);將共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.9.1軟件中,繪制出“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4基因通路和功能分析 將預(yù)測(cè)的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),采用GO富集分析及KEGG通路富集分析HBOC聯(lián)合EDA治療ACI中的生物過程及信號(hào)通路,設(shè)置P<0.05為篩選條件,選擇排名靠前的生物過程及信號(hào)通路,使用R語言對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化,繪制條形圖與氣泡圖。

1.2.5“藥物-靶點(diǎn)-疾病-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的獲得 選擇P值最小的前4個(gè)通路的氣泡圖,在Cytoscape 3.9.1軟件中構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行可視化分析;將關(guān)鍵通路的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),將物種設(shè)置為“Homo sapiens”,檢索蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系,設(shè)置最低的相互作用閾值(中等置信度=0.4),其他參數(shù)保持在默認(rèn)值;結(jié)果被保存為TSV文件后,導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1軟件中,將節(jié)點(diǎn)的大小和顏色與程度相關(guān),并將邊緣的厚度與聯(lián)合評(píng)分相關(guān),繪制出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI),篩選核心靶點(diǎn)。

1.2.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備及分組 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、HBOC治療組、EDA治療組、HBOC聯(lián)合EDA治療組(聯(lián)合治療組),每組24只。按參考文獻(xiàn)［15］方法建立大鼠大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,建模3 h后,采用微量注射泵將生理鹽水(6 mL/kg)、HBOC(6 mL/kg)、EDA注射液(1.5 mL/kg)、或HBOC(6 mL/kg)和EDA注射液(1.5 mL/kg)聯(lián)合經(jīng)微導(dǎo)管分別持續(xù)泵入模型組、HBOC治療組、EDA治療組、聯(lián)合治療組大鼠頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端,除假手術(shù)組外其余各組大鼠繼續(xù)梗死1 h后取出線栓,恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注;而假手術(shù)組僅分離大鼠動(dòng)脈,不插入線栓,即僅給予麻醉及頸正中切口,然后縫合。

1.2.7神經(jīng)功能缺損評(píng)分 術(shù)后24 h,運(yùn)用Zea Longa法神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分:神經(jīng)缺損癥狀不明顯、活動(dòng)正常為0分,提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢體不完全伸直為1分,向患側(cè)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分,向患側(cè)對(duì)側(cè)傾倒為3分,活動(dòng)障礙、意識(shí)喪失為4分。

1.2.8腦缺血梗死灶及腦水腫體積的測(cè)定 完成神經(jīng)功能評(píng)分后,將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后斷頭處死,立即取出腦組織放入-20 ℃冰箱,冷凍20 min后放置于腦槽內(nèi),從額極開始向后切下厚度約2 mm的5張連續(xù)冠狀腦組織切片,并迅速置于10 mL含1% 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中, 37 ℃避光培養(yǎng)30 min,每5 min晃動(dòng)、翻面1次(保證腦片著色均勻)。染色結(jié)束后,將切片轉(zhuǎn)移到4%多聚甲醛溶液中固定24 h,取出固定好的腦切片拍照留存,應(yīng)用Image J軟件(Image J 1.37v)圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,按參考文獻(xiàn)［16］計(jì)算腦梗死灶體積及腦水腫體積。

1.2.9蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腦組織神經(jīng)元變化 每組隨機(jī)取6只大鼠,于術(shù)后24 h麻醉斷頭處死,迅速取出患側(cè)額葉腦皮質(zhì)組織,用4%多聚甲醛固定標(biāo)本2 h,蒸餾水浸泡4 h,脫水、浸蠟、包埋、切片等處理后進(jìn)行HE染色。高倍鏡下(400×)觀察各切片相同部位的大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài),每組隨機(jī)選擇皮質(zhì)區(qū)的5個(gè)視野拍照。

1.2.10流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡 參考文獻(xiàn)［17］,每組隨機(jī)取6只大鼠,于術(shù)后24 h麻醉斷頭處死,收集患側(cè)額葉腦皮質(zhì)組織,用400 μL預(yù)冷PBS洗滌腦細(xì)胞2次,用30 μm孔徑的過濾器過濾,并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×109CFU/L,以2 000 r/min離心10 min,棄上清液后加入1×膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)結(jié)合液400 μL及膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)染色液5 μL,輕懸混勻于2～8 ℃避光條件下孵育15 min,再加入碘化丙啶(PI)染色液10 μL,輕懸混勻,2～8 ℃避光條件下孵育5 min,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,Annexin V以FITC標(biāo)記,配合PI同時(shí)染色檢測(cè)凋亡,使用525 nm的帶通濾片檢測(cè)FITC,使用610 nm的帶通濾片檢測(cè)PI,分別通過FITC和PI對(duì)數(shù)熒光散點(diǎn)圖分析凋亡細(xì)胞、活細(xì)胞和壞死細(xì)胞百分率。根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn),在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細(xì)胞,左上象限顯示壞死細(xì)胞,右上象限為晚期凋亡細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞。在每一散點(diǎn)圖的下方列出各象限的比例,可得到該散點(diǎn)圖中壞死細(xì)胞百分率、晚期凋亡細(xì)胞百分率、早期凋亡細(xì)胞百分率及活細(xì)胞百分率。

1.2.11Western blot驗(yàn)證核心靶點(diǎn)基因的表達(dá) 每組隨機(jī)取6只大鼠,于術(shù)后24 h麻醉斷頭處死,迅速取出患側(cè)額葉腦皮質(zhì)組織加入含有適量液氮的研缽里,研磨后加入組織裂解液,放入組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿,使組織盡量碾碎,在冰上靜置15～30 min使之充分裂解。將勻漿液放入離心管中12 000 r/min離心30 min,上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷離心管中,處理蛋白隨后上樣。采用SDS-PAGE分離總蛋白,隨后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將一抗(Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α、GAPDH)用抗體稀釋液按適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行稀釋,PVDF膜用一抗于4 ℃孵育過夜,然后用二抗室溫孵育2 h后顯影。將膠片進(jìn)行掃描,采用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值,目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值等于目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 共同靶點(diǎn)的篩選及“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合PharmMapper、Swiss Target Prediction及Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù),獲得HBOC對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)308個(gè)、EDA對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)90個(gè)、ACI對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)1 109個(gè),在Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)上,繪制維恩圖,結(jié)果顯示HBOC、EDA和ACI共同靶點(diǎn)106個(gè),見圖1。在Cytoscape 3.9.1軟件中輸入藥物與疾病的共同靶點(diǎn),構(gòu)建“HBOC/EDA-靶點(diǎn)-ACI”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。

注：紫色為HBOC對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),藍(lán)色為EDA對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),綠色為ACI對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),藥物與疾病的交集為共同靶點(diǎn)。

注：黃色為藥物HBOC及EDA、藍(lán)色為藥物與疾病的106個(gè)共同靶點(diǎn)、紅色為疾病ACI。

2.2 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將HBOC聯(lián)合EDA治療ACI的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析。GO富集分析顯示共同靶點(diǎn)與凋亡過程的調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)、藥物反應(yīng)等生物過程相關(guān),KEGG通路富集分析顯示共同靶點(diǎn)主要參與IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。見圖3。

注：A為共同靶點(diǎn)的GO富集分析結(jié)果中P值排名前10的途徑繪制的條形圖,BP為生物學(xué)過程、CC為細(xì)胞組分、MF為分子功能;B為共同靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析結(jié)果中P值排名前20的通路繪制的氣泡圖。

2.3 “藥物-疾病-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的獲得

結(jié)果顯示,在前4個(gè)關(guān)鍵通路中有32個(gè)靶點(diǎn)被富集(圖4)。為了進(jìn)一步探討在關(guān)鍵通路中可能存在的核心靶點(diǎn),構(gòu)建關(guān)鍵通路中富集的32個(gè)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α等靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)相對(duì)較大,顏色相對(duì)較暗,提示有較高的度值,表明它們可能是HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵靶點(diǎn),可能在評(píng)價(jià)治療效果中發(fā)揮重要作用(圖5)。

注：淺紅色ACI,紫色代表4種關(guān)鍵通路,綠色表示參與通路的32個(gè)靶點(diǎn),淺棕色代表藥物(EDA與HBOC);節(jié)點(diǎn)之間的邊緣代表它們之間的相互作用。

注：圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)之間的直線表示兩個(gè)連接蛋白之間的相互作用;圓圈越大,顏色越深,度值就越大;線越厚,蛋白質(zhì)之間的結(jié)合就越近。

2.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

術(shù)后24 h,模型組和各治療組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5); HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),聯(lián)合治療組低于HBOC治療組和EDA治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后24 h的神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.5 大鼠腦梗死灶體積與腦水腫體積

術(shù)后24 h,與假手術(shù)組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠的腦梗死灶體積和腦水腫體積增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組,EDA治療組和聯(lián)合治療組的腦梗死灶體積和腦水腫體積明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中,聯(lián)合治療組腦梗死體積和腦水腫體積明顯低于HBOC治療組和EDA治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后24 h腦梗死灶體積及腦水腫體積比較

2.6 大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)觀察

結(jié)果顯示,術(shù)后24 h,假手術(shù)組大鼠腦組織中可觀察到正常神經(jīng)元細(xì)胞,神經(jīng)元排列密集整齊、層次清晰、結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)元形態(tài)圓潤(rùn)、輪廓清晰、胞內(nèi)胞質(zhì)均勻、細(xì)胞核正常居中;模型組大鼠腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯異常,細(xì)胞排列相對(duì)紊亂,形態(tài)不規(guī)則,大量細(xì)胞皺縮,核染色質(zhì)固縮、邊集、碎片化,大量凋亡小體形成;HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織中正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)不同程度減少,胞體腫脹變形,排列疏松,形態(tài)不規(guī)則,核仁不同程度固縮、碎片化。HBOC治療組與EDA治療組大鼠腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞排列較模型組清楚,較聯(lián)合治療組紊亂。聯(lián)合治療組大鼠腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞排列規(guī)則,邊界清晰,碎片化核仁和凋亡小體顯著減少。見圖6。

圖6 各組大鼠術(shù)后24 h腦組織中神經(jīng)元形態(tài)

2.7 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡

術(shù)后24 h,與假手術(shù)組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織出現(xiàn)大量細(xì)胞壞死、凋亡細(xì)胞數(shù)量增多、正常細(xì)胞數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的凋亡細(xì)胞數(shù)量減少、正常細(xì)胞增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);聯(lián)合治療組壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞數(shù)量低于HBOC治療組與EDA治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7和表3。

表3 各組大鼠術(shù)后24 h腦組織的細(xì)胞凋亡率比較

圖7 各組大鼠術(shù)后24 h腦組織的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.8 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)

術(shù)后24 h,與假手術(shù)組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平下調(diào),其中,聯(lián)合治療組的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平低于HBOC治療組與EDA治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

注：A為Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果,B為Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白的定量結(jié)果;(1)與假手術(shù)組相比,P<0.05;(2)與模型組相比,P<0.05;(3)與HBOC治療組相比,P<0.05;(4)與EDA治療組相比,P<0.05。

3 討論

ACI發(fā)生以后,缺血腦組織會(huì)發(fā)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),梗死局部間質(zhì)水腫、腦血管受壓、微血栓聚集,進(jìn)而使紅細(xì)胞無法到達(dá)病灶部位,組織缺血缺氧對(duì)半暗帶進(jìn)一步損害,最終導(dǎo)致更大面積的病損及更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失［18］。針對(duì)治療缺血性損傷的多種方法,聯(lián)合治療比單一治療策略具有優(yōu)勢(shì)［19-20］。本研究結(jié)合HBOC與EDA的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物學(xué)驗(yàn)證,探討其聯(lián)合治療對(duì)ACI的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)多學(xué)科的研究領(lǐng)域,通過建立數(shù)據(jù)庫(kù)、建立網(wǎng)絡(luò)、分析網(wǎng)絡(luò)和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來解釋疾病的發(fā)展過程［21-22］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用組學(xué)整合了系統(tǒng)生物學(xué),為從生物平衡的角度探索中藥或天然活性物質(zhì)的作用機(jī)制和開發(fā)中藥活性成分提供了有力的工具。此外,還可以直觀地呈現(xiàn)藥物-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)圖,可以預(yù)測(cè)治療過程中的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,進(jìn)而預(yù)測(cè)其潛在的作用機(jī)制,這是開發(fā)新藥的有效途徑之一［23-25］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)HBOC聯(lián)合EDA治療ACI的106個(gè)共同靶點(diǎn),并分析了這些靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路富集分析,預(yù)測(cè)在治療過程中可能發(fā)揮的作用,并檢測(cè)靶點(diǎn)的程度值。結(jié)果顯示這些靶點(diǎn)參與凋亡過程的調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)等生物過程,并可能通過IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等途徑在ACI治療中起神經(jīng)保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步探討在關(guān)鍵通路中可能存在的核心靶點(diǎn),本研究構(gòu)建了通路中富集的32個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α可作為HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究證實(shí),腦組織缺血缺氧后會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序,細(xì)胞凋亡的過程是水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程［26］。Caspase-3作為Caspase家族蛋白的凋亡執(zhí)行因子,是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終執(zhí)行蛋白［27］。腦缺血損傷發(fā)生后,細(xì)胞內(nèi)會(huì)生成大量氧自由基,隨著細(xì)胞膜被逐漸破壞,溶酶體、線粒體等細(xì)胞器均受到不同程度損傷,凋亡蛋白Caspase-3經(jīng)不同途徑被激活,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子,它存在于人體和哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi),對(duì)細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)以及介導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境起關(guān)鍵性作用［28］。HIF-1α在細(xì)胞缺血缺氧時(shí)表達(dá)上調(diào),位于下游的促凋亡基因表達(dá)受到調(diào)控后表達(dá)增加,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡,HIF-1α表達(dá)的上調(diào)與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)的關(guān)系［29］。缺血性腦損傷伴隨著明顯的炎性反應(yīng),炎性反應(yīng)由炎癥細(xì)胞的積聚和炎癥介質(zhì)的表達(dá)引起并加重,炎性反應(yīng)的抑制可以保護(hù)缺血性腦損傷［30］。在炎性反應(yīng)中,IL-6、TNF-α起著重要作用。IL-6是腦缺血炎性反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì),其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥加重了腦損傷,在缺血和缺氧刺激下,IL-6在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯升高,而抑制IL-6表達(dá)可以減輕缺血缺氧造成的損傷［31］。TNF-α是腦梗死后的重要炎性因子,可直接損傷腦組織,同時(shí)能誘導(dǎo)局部組織產(chǎn)生炎性因子,引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［32］。經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè),在本研究中,Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α可作為HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究結(jié)果也顯示,檢測(cè)Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α含量的變化可能作為HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵指標(biāo),可能在評(píng)價(jià)治療效果中發(fā)揮重要作用。

本研究的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)主要在行為學(xué)水平、細(xì)胞水平、分子水平等方面進(jìn)行療效評(píng)估。神經(jīng)功能評(píng)分是評(píng)價(jià)腦損傷病情預(yù)后的重要依據(jù)［8］。本研究采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)HBOC聯(lián)合EDA對(duì)ACI大鼠神經(jīng)功能的改善效果,結(jié)果顯示聯(lián)合用藥后大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低。此外,研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療在減輕腦梗死體積和水腫體積的作用上均較單獨(dú)治療有更好的效果。提示聯(lián)合治療方案對(duì)大鼠腦梗死后的神經(jīng)功能缺損癥狀有明顯的改善作用,且其療效優(yōu)于單獨(dú)用藥方案。另一方面,本研究通過HE染色觀察各組大鼠腦組織神經(jīng)元變化,結(jié)果表明聯(lián)合用藥能有效改善腦缺血的神經(jīng)元病變。

在本研究中,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織的Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達(dá)水平均較假手術(shù)組明顯升高,同時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡程度顯示模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組出現(xiàn)大量細(xì)胞壞死,細(xì)胞凋亡數(shù)量增多,正常細(xì)胞數(shù)量明顯減少,說明腦梗死后細(xì)胞凋亡程序被啟動(dòng),凋亡因子Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達(dá)水平上調(diào)。通過與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達(dá)水平均有不同程度的降低,流式細(xì)胞術(shù)顯示腦組織凋亡、壞死細(xì)胞比例減少、正常細(xì)胞增多,說明在腦梗后凋亡程序的啟動(dòng)中,各治療組對(duì)細(xì)胞凋亡均表現(xiàn)出不同的抑制作用。其中,聯(lián)合治療組細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯低于HBOC治療組與EDA治療組,表明聯(lián)合治療對(duì)腦梗死后啟動(dòng)的凋亡程序具有更明顯的抑制作用,通過下調(diào)凋亡因子Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達(dá)水平,從而發(fā)揮更明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。此外,本研究發(fā)現(xiàn),IL-6、TNF-α等炎癥因子在腦梗死后的蛋白表達(dá)水平表現(xiàn)出明顯升高趨勢(shì),提示腦梗死后炎性反應(yīng)被激活。與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合用藥治療組的IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平均有不同程度的降低,說明各治療組對(duì)腦梗死后出現(xiàn)的炎性反應(yīng)均有不同程度的抑制作用。其中,聯(lián)合治療組的IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平明顯低于HBOC治療組與EDA治療組,說明聯(lián)合用藥對(duì)腦梗死后的炎性反應(yīng)的抑制作用更大,從而發(fā)揮更明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,預(yù)測(cè)HBOC與EDA聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng),并通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)在行為學(xué)水平、細(xì)胞水平、分子水平等方面進(jìn)行療效評(píng)估,初步證明HBOC和EDA聯(lián)合治療可以明顯改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,減輕腦水腫和梗死體積,抑制細(xì)胞凋亡,且療效較單一用藥更為明顯,其聯(lián)合用藥的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能通過多靶點(diǎn)、多途徑方式減輕炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡。本研究為今后臨床實(shí)驗(yàn)的開展和ACI的治療提供了新的思路。