鐘清清 趙直 徐冰一 朱路路 吳旭龍 楊佳磊 古聯(lián) 蘇莉

【摘要】 目的 探討磷脂酰肌醇聚糖錨生物合成M類（PIGM）基因rs2275404、ATP酶H+轉(zhuǎn)運V1亞單位B2（ATP6V1B2）基因rs1042426、N-乙酰神經(jīng)氨酸磷酸酶（NANP）基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中及其血脂水平的關(guān)聯(lián)性。

方法 共納入1567名研究對象，其中缺血性腦卒中患者774例，健康對照者793例?；蚍中筒捎肕assarray SNP技術(shù)，應(yīng)用非條件logistic回歸模型分析加性模型、顯性模型、隱性模型與疾病的關(guān)聯(lián)。

結(jié)果 PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426和NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中患者易感性無遺傳關(guān)聯(lián)（均P>0.05）。在調(diào)整性別年齡后，PIGM基因rs2275404多態(tài)性與缺血性腦卒中甘油三酯水平顯著相關(guān)（隱性模型：βadj=-0.26，95% CI=-0.47～0.05，Padj=0.015）；ATP6V1B2基因rs1042426多態(tài)性與缺血性腦卒中載脂蛋白B水平顯著相關(guān)（加性模型：βadj=0.06，95% CI=7.77×10-4 ～0.12，Padj=0.048；顯性模型：βadj= 0.07，95% CI=4.28×10-3～0.14，Padj=0.037）；NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中載脂蛋白A1水平也顯著相關(guān)（顯性模型：βadj=0.05，95% CI=2.86×10-4～0.09，Padj=0.049）。

結(jié)論 未發(fā)現(xiàn)PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426、NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險相關(guān)，但是可影響缺血性腦卒中患者血脂水平。

【關(guān)鍵詞】 缺血性腦卒中；基因多態(tài)性；血脂；關(guān)聯(lián)研究

中圖分類號：R743.3?? 文獻標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.007

Study on association between single nucleotide polymorphisms of PIGM，ATP6V1B2 and NANP genes and ischemic stroke and its blood lipid level

ZHONG Qingqing1， ZHAO Zhi1， XU Bingyi1， ZHU Lulu1， WU Xulong1， YANG Jialei1， GU Lian2， SU Li1

（1. School of Public Health， Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China;2. Department of Internal Neurology，

the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530023， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the associations between the polymorphisms of phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class M （PIGM） gene rs2275404， ATPase H+ transporting V1 subunit B2 （ATP6V1B2） gene rs1042426， N-acetylneuraminic acid phosphatase （NANP） gene rs11700338 and ischemic stroke （IS） and its blood lipid level.

Methods A total of 1567 subjects were enrolled in the study， including 774 cases of IS and 793 controls. Massarray SNP technique was used for genotyping， and unconditional logistic regression model was used to analyze association between genetic models （additive model， dominant model， and recessive model） and diseases.

Results There was no genetic association between the polymorphisms of PIGM gene rs2275404， ATP6V1B2 gene rs1042426 and NANP gene rs11700338 and the susceptibility of IS （all P>0.05）.After adjusting age and gender， PIGM gene rs2275404 was significantly correlated with the triglyceride level of IS （recessive model： βadj=-0.26， 95% CI=-0.47 - 0.05， Padj= 0.015）;ATP6V1B2 gene rs1042426 was significantly correlated with the apolipoprotein B level of IS （additive model： βadj= 0.06， 95% CI= 7.77×10-4? - 0.12， Padj=0.048;dominant model： βadj=0.07， 95% CI=4.28×10-3? - 0.14， Padj=0.037）;and NANP gene rs11700338 was significantly correlated with apolipoprotein A1 level of IS （dominant model： βadj=0.05， 95% CI=2.86×10 -4 - 0.09， Padj=0.049）.

Conclusion The polymorphisms of PIGM gene rs2275404， ATP6V1B2 gene rs1042426， and NANP gene rs11700338 are not associated with the risks of ischemic stroke， but they may affect the blood lipid levels of patients with ischemic stroke.

【Key words】 ischemic stroke（IS）; gene polymorphism; blood lipids; relevance research

缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率和高復(fù)發(fā)率的特點，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給全球帶來了沉重的疾病負(fù)擔(dān)［1］，同時也是導(dǎo)致我國人口死亡和長期殘疾的主要原因［2］。IS是多基因復(fù)雜疾病，遺傳因素在IS的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，IS的易感基因探索也是研究重點［3］。與代謝途徑相關(guān)的基因，比如參與同型半胱氨酸代謝的亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因［4］、脂質(zhì)代謝的載脂蛋白 E（APOE）基因［5］與IS發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T與血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）4G/5G基因多態(tài)性以及與葉酸代謝途徑相關(guān)的還原性葉酸載體（SLC19A1）基因rs1131596、rs1051266、rs12659可增加IS的發(fā)生風(fēng)險［6-7］。磷脂酰肌醇聚糖錨生物合成M類（PIGM）基因、ATP酶H+轉(zhuǎn)運V1亞單位B2（ATP6V1B2）基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸磷酸酶（NANP）基因也屬于代謝通路基因。此外血脂異常在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用［8］，是缺血性腦卒中常見的危險因素。為了揭示缺血性腦卒中的遺傳因素，識別新的治療靶點，可以有效地改善患者預(yù)后，減輕疾病負(fù)擔(dān)，本研究主要探討了PIGM、ATP6V1B2和NANP基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點與IS及其血脂水平的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年9月至2017年6月期間1567名研究對象，其中病例組774例，均來自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科確診為缺血性腦卒中的患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1995年中華醫(yī)學(xué)會第四次全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的《各類腦血管病診斷要點》，所有患者均經(jīng)頭顱CT和/或MRI確診，排除因腦血管畸形、短暫性腦缺血發(fā)作、血液病、腫瘤、動脈炎、腦外傷、藥物等引起的缺血性腦卒中患者；對照組793例，為上述醫(yī)院體檢中心參加體檢的正常人，與病例組的年齡和性別相匹配，排除有腎臟、肝臟、心臟等重大疾病患者以及自身免疫系統(tǒng)疾病患者。所有研究對象無血緣關(guān)系，均簽署知情同意書。這項研究已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 SNP的選擇

從HapMap網(wǎng)站中下載PIGM、ATP6V1B2和NANP基因的基因型數(shù)據(jù)，選出中國漢族人群數(shù)據(jù)。SNPs位點根據(jù)連鎖不平衡（LD）r2>0.8，小等位基因頻率（MAF）>0.05，哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）P值>0.05選擇功能性位點。見表1。

1.3 基因分型

通過采集每位研究對象清晨空腹血2 mL（乙二胺四乙酸抗凝管），并嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品）說明書實驗流程來提取血液基因組DNA，質(zhì)檢合格后轉(zhuǎn)移至-80 ℃的低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。使用NanoDrop2000儀器檢測DNA吸光度（OD）以及1.25%瓊脂糖凝膠電泳來檢測提取的DNA質(zhì)量，OD值260/280在1.6～1.8之間為DNA質(zhì)檢合格。采用 AssayDesigner 3.1 軟件設(shè)計PCR反應(yīng)和引物，并交由博淼生物科技（北京）有限公司合成。引物序列見表2。在Agena平臺，采用Massarray SNP基因分型實驗技術(shù)，由生物公司進行基因多態(tài)性位點的基因分型檢測。

1.4 臨床指標(biāo)測定

用非抗凝真空采血管采集每位研究對象2 mL清晨空腹血，使用HITACHI日立7600全自動生化分析儀，按照標(biāo)準(zhǔn)化實驗程序檢測以下指標(biāo)的血清水平：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）、載脂蛋白A1（APO-A1）、載脂蛋白B（APO-B）水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

遺傳關(guān)聯(lián)分析運用PLINK軟件進行分析：用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析HWE，采用χ2檢驗對基因型頻率分布、等位基因頻率分布進行組間比較。應(yīng)用非條件logistic回歸模型，以是否發(fā)生腦梗死為應(yīng)變量，以各遺傳模型（A1：小等位基因；A2：大等位基因；加性模型：A1A1 vs A1A2 vs A2A2、顯性模型：A1A1＋A1A2 vs A2A2；隱性模型：A1A1 vs A1A2＋A2A2）下的基因型為自變量，分析與疾病的關(guān)聯(lián)，其中關(guān)聯(lián)強度用比值比（OR）及95％置信區(qū)間（CI）表示。使用Linear回歸分析多態(tài)性位點與缺血性腦卒中患者的血脂水平的關(guān)聯(lián)，其中應(yīng)變量為患者的具體血脂水平，自變量為各遺傳模型下的基因型。此外，運用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用頻數(shù)或百分率表述，組間比較使用χ2檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料用（±s）表示，組間比較使用兩獨立樣本t檢驗。所有統(tǒng)計學(xué)的檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)? 果

本研究共納入1567名研究對象，病例組774例，平均年齡（64.12±10.34）歲，男459例、女315例；對照組793例，平均年齡（63.81±10.36）歲，男437例、女356例。病例組與對照組在性別（χ2=2.815，P=0.093）、年齡（t=-0.582，P=0.561）上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

2.1 基因型分布頻率以及HWE檢驗

HWE檢驗顯示，PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426、NANP基因rs11700338多態(tài)性的基因型分布均符合HWE遺傳平衡定律（PHWE >0.05）；病例組與對照組間PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426、NANP基因rs11700338多態(tài)性的基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。病例組與對照組間PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426、NANP基因rs11700338多態(tài)性的等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。見表4。

2.2 PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426和NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險關(guān)聯(lián)分析

多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，在加性模型、顯性模型、隱性模型三個遺傳模型中，PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426和NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。見表5。

2.3 PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426和NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中患者血脂水平的相關(guān)分析

Linear回歸分析結(jié)果顯示，在校正性別年齡后，PIGM基因rs2275404多態(tài)性與缺血性腦卒中TG水平顯著相關(guān)（隱性模型：βadj=-0.26，95% CI=-0.47～0.05，Padj=0.015）。PIGM基因rs2275404多態(tài)性與缺血性腦卒中的APO-A1、APO-B、HDL、LDL、VLDL、TC水平的相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。見表6。ATP6V1B2基因rs1042426多態(tài)性與缺血性腦卒中APO-B水平顯著相關(guān)（加性模型：βadj=0.06，95%CI =7.77×10-4～0.12，Padj=0.048，顯性模型：βadj=0.07，95% CI=4.28×10-3～0.14，Padj=0.037）；ATP6V1B2基因rs1042426多態(tài)性與缺血性腦卒中的APO-A1、HDL、LDL、VLDL、TC、TG水平的相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表7。NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中APO-A1水平顯著相關(guān)（顯性模型：βadj=0.05，95% CI=2.86×10-4～0.09，Padj=0.049）；NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中的APO-B、HDL、LDL、VLDL、TC、TG水平的相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。見表8。

3 討? 論

本研究未發(fā)現(xiàn)PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426、NANP基因rs11700338多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)聯(lián)。目前這3個基因多態(tài)性位點尚未有文獻報道，本研究首次發(fā)現(xiàn)rs2275404、rs1042426、rs11700338與血脂水平顯著相關(guān)：PIGM基因rs2275404與TG水平顯著相關(guān)；ATP6V1B2基因rs1042426與APO-B水平顯著相關(guān)；NANP基因rs11700338多態(tài)性與APO-A1水平顯著相關(guān)。

PIGM基因參與糖基磷脂酰肌醇（GPI）生物合成。GPI結(jié)構(gòu)對于GPI微結(jié)構(gòu)域的形成和某些GPI錨定蛋白的功能是必需的。如果GPI結(jié)構(gòu)被跨膜蛋白取代，那么該蛋白的功能就會喪失［9］。GPI特異性磷脂酶D（GPI-PLD）參與脂質(zhì)代謝，可影響甘油三酯和血漿脂蛋白代謝。另外，動物實驗表明，通過腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移增加C57BL/6小鼠肝臟GPI-PLD的表達(dá)，這種變化與空腹（30%）和餐后甘油三酯（50%）水平增加以及富含甘油三酯的脂蛋白分解代謝降低兩倍有關(guān)，提示GPI-PLD可通過改變富含TG的脂蛋白的分解代謝影響血清TG水平［10］。因此，PIGM基因 rs2275404可能通過影響GPI-PLD的GPI結(jié)構(gòu)來影響體內(nèi)TG水平。

ATP6V1B2基因編碼囊泡型質(zhì)子泵蛋白（V-ATPase）。V-ATPase依賴的細(xì)胞器酸化是細(xì)胞內(nèi)過程（例如蛋白質(zhì)分類、酶原激活、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和突觸小泡質(zhì)子梯度生成）所必需的。溶酶體膜上的V-ATPase通過將質(zhì)子中的質(zhì)子連續(xù)泵入溶酶體來維持其內(nèi)部酸性環(huán)境［11］。APO-B脂蛋白被認(rèn)為是動脈粥樣硬化的主要危險因素，也是動脈粥樣硬化病變中膽固醇的主要來源。在本研究中，ATP6V1B2基因rs1042426與APO-B水平顯著相關(guān)。APO-B α1β區(qū)是微粒體甘油三酸酯轉(zhuǎn)移蛋白（MTTP）的結(jié)合位點，后者將甘油三酸酯轉(zhuǎn)移至APO-B進行組裝VLDL，敲除APO-B α1β區(qū)或該區(qū)域帶正電荷的精氨酸和賴氨酸突變?yōu)橹行园被峥上鼳PO-B與MTTP之間的相互作用，并防止或減少APO-B的分泌［12-14］。因此，ATP6V1B2基因可能通過V-ATPase調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境，從而影響氨基酸的電負(fù)性，這種情況會影響體內(nèi)APO-B的水平。

NANP基因編碼的蛋白質(zhì)是一種參與合成唾液酸（SA）的酶，其中N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）是SA最常見的衍生物［15］。動物實驗表明，高脂飲食喂養(yǎng)會導(dǎo)致高脂血癥，但在較高劑量下補充Neu5Ac可以減弱高脂飲食誘導(dǎo)的變化，提示Neu5Ac可用于預(yù)防高脂血癥相關(guān)的炎癥和氧化應(yīng)激［16］。另一動物實驗表明，與正常飲食的小鼠相比，高脂飲食持續(xù)12周可導(dǎo)致肝臟組織中APO-A1基因表達(dá)顯著增加［17］。APO-A1是HDL的主要組成蛋白，能反映機體的血脂代謝情況，促進脂質(zhì)代謝和膽固醇分解的酶活性，它也可以起到抗氧化和消炎的作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)NANP基因rs11700338與APO-A1的水平顯著相關(guān)，我們推測Neu5Ac與APO-A1可能存在協(xié)同作用，有待進一步實驗驗證。

綜上所述，PIGM基因rs2275404、ATP6V1B2基因rs1042426、NANP基因rs11700338多態(tài)性與IS的發(fā)生風(fēng)險無關(guān)聯(lián)，但是與IS患者的血脂水平相關(guān)。而血脂水平是缺血性腦卒中的一個重要危險因素，因此缺血性腦卒中相關(guān)基因仍需進一步探討。

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（收稿日期：2022-09-01 修回日期：2023-02-01）

（編輯：王琳葵 梁明佩）