吳菁 王禹 覃宏平 王其財 黃春妮 姚奕斌 凌志安 李若林

【摘要】 目的 探討生長分化因子15 （growth differentiation factor 15，GDF15）在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中的表達，并初步分析其對細胞生物學功能的影響。

方法 應用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）檢測GDF15在多發(fā)性骨髓瘤細胞株MM.1R 中的表達水平。再通過構(gòu)建 GDF15的過表達和沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MM.1R細胞株，檢測細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲、細胞周期和凋亡。

結(jié)果 在72 h、96 h、120 h三個時間點，過表達GDF15組細胞增殖較陰性對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）；過表達GDF15后MM.1R細胞的遷移和侵襲能力有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在72 h和96 h，沉默GDF15組細胞增殖較陰性對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與陰性對照組相比，沉默GDF15組能顯著抑制MM.1R細胞的遷移和侵襲能力。48 h后，沉默組G0/G1期細胞比例顯著高于陰性對照組，沉默組S期細胞比例顯著低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05），但未見明顯誘導MM.1R細胞凋亡的作用。

結(jié)論 GDF15基因影響多發(fā)性骨髓瘤細胞MM.1R的增殖、遷移和侵襲能力，并調(diào)節(jié)細胞周期，這可能會促進多發(fā)性骨髓瘤的進展。

【關鍵詞】 多發(fā)性骨髓瘤；生長分化因子15（GDF15）；生物學行為；細胞增殖；細胞遷移

中圖分類號：R733.3?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.004

Expression and biological role of growth differentiation factor 15 in multiple myeloma cells of MM.1R

WU Jinga， WANG Yua， QIN Hongpingb， WANG Qicaia， HUANG Chunnia， YAO Yibinc， LING Zhiand， LI Ruolinb

（a. Department of Laboratory Medicine， b. Clinical Medical Experiment Center， c. Department of Hematology， d. Department of

Orthopedics， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the expression of growth differentiation factor 15 （GDF15） in multiple myeloma （MM）， and to preliminarily analyze its effect on cell biological function.

Methods The expression level of GDF15 in multiple myeloma cell line MM.1R was detected by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. The MM.1R cell lines were then transfected by constructing overexpression and silent plasmids of GDF15， and cell proliferation， cell migration， cell invasion， cell cycle and apoptosis were detected.

Results At 72 h， 96 h and 120 h， cell proliferation in overexpressed GDF15 group was significantly higher than that in negative control group， and difference was statistically significant （all P<0.05）;the migration and invasion capacity of MM.1R cells were increased with the GDF15 overexpression， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. At 72 h and 96 h， cell proliferation in silence GDF15 group was significantly lower than that in the negative control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）;compared with the negative control group， the silence GDF15 group significantly inhibited the migration and invasion of MM.1R cells. After 48 h， the proportion of cells in G0/G1 phase in the silence group was significantly higher than that in the negative control group， and the proportion of cells in? S phase in the silence group was significantly lower than that in the negative control group， the differences were statistically significant（all P<0.05）， but there was no obvious effect on inducing apoptosis of MM.1R cells.

Conclusion GDF15 gene affects the proliferation， migration， and invasion ability of multiple myeloma cells MM.1R， and regulates cell cycle， which may promote the progression of multiple myeloma.

【Key words】 multiple myeloma; growth differentiation factor 15（GDF15）; biological behavior; cell proliferation; cell migration

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以漿細胞異常增生和分泌大量單克隆免疫球蛋白（M 蛋白）或本周氏蛋白為特征的一種惡性腫瘤性疾?。?］。MM 發(fā)病率為 （1～2）/10萬［2］，是很多國家（包括中國）血液系統(tǒng)排名第二位的常見惡性腫瘤［3］。目前 MM 仍屬于不可治愈的疾病，臨床表現(xiàn)多樣化，起病緩慢，早期可數(shù)月至十多年無臨床癥狀，治療難度大，早期易被誤診，預后評估仍存在很大的局限性。因此，探索新的診斷生物標志物或治療靶點至關重要。

生長分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）能調(diào)劑腫瘤細胞干性程序化死亡分子（programmed death 1，PD-1）和細胞程式死亡-配體1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1），既有致瘤作用，也有抗腫瘤的作用，但大部分報道都是以其發(fā)揮致瘤作用為主［4］。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)GDF15在MM患者血清中處于高表達水平，其遺傳位點與MM的ISS期和DS分期有一定的相關性［5］。因此，筆者推測GDF15可能作為MM細胞形成的關鍵誘導因子或MM細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)因子，參與了MM腫瘤微環(huán)境生物學過程。但目前有關GDF15基因?qū)M細胞生物學功能研究的文獻報道較少，未見對MM.1R細胞的表型作用進行研究。

本研究以人多發(fā)性骨髓瘤細胞株MM.1R為研究對象，通過檢測GDF15在MM.1R 細胞中的表達水平，并構(gòu)建 GDF15的過表達和沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞MM.1R，觀察GDF15基因?qū)M細胞生物學行為的影響，為進一步明確GDF15基因在MM發(fā)病機制中的作用提供細胞水平的信息。

1 材料與方法

1.1 研究對象

人多發(fā)性骨髓瘤細胞株MM.1R（BFN60804002），購自上海中科院細胞庫。

1.2 儀器與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基（C11875500BT），美國Invitrogen公司；胎牛血清（10270-106）和0.25%胰蛋白酶（25300062），美國Gibco公司；Transwell小室（8 μm孔徑）（3422）和Matrigel Matrix（354230），Corning公司；CCK-8試劑（LB788），Dojindo公司；Trizol試劑盒（15596-026），Thermo公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000-015），美國Invitrogen 公司；jet PRIME試劑盒（PT-114-15）和INTERFERin？倕

試劑盒（409-10），美國polyplus公司；qRT-PCR試劑盒（208054），QIAGEN公司；細胞周期（550825）檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒（556547），BD Biosciences公司；GDF15質(zhì)粒（HG10936-UT）及空載質(zhì)粒、siRNA-GDF15及陰性對照siRNA，SinoBiological公司；臺式高速冷凍離心機（H1850R），湖南湘儀有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640作為培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將細胞放置于37 ℃，5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔3～5 天傳代一次。

1.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，過表達組轉(zhuǎn)染GDF15過表達載體，沉默組細胞轉(zhuǎn)染siRNA-GDF15，陰性對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)?；蜿幮詫φ誷iRNA，空白對照組細胞不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，采用 qRT-PCR檢測細胞轉(zhuǎn)染效率（測定細胞中GDF15 mRNA表達水平）。

1.3.3 RNA提取和qRT-PCR?? 應用

Trizol提取MM.1R細胞株的總 RNA，檢測RNA濃度和純度后， 以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參檢測GDF15 mRNA的表達水平。GAPDH上游引物為5'-AATCAAGTGGGGCGATGCTG，下游引物為5'-GCAAATGAGCCCCAGCCTTC；GDF15上游引物為5'-ACTCACGCCAGAAGTGCGG，下游引物為5'-TCACGTCCCACGACCTTGAC。qRT-PCR反應參數(shù)為2 min，95 ℃，5 s，95 ℃，30 s，60 ℃，40個循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)運用2-ΔΔCt方法計算表達量。

1.3.4 CCK-8檢測細胞增殖活性

將各組細胞制備成2×105個/mL細胞懸液，分別取100 μL接種在96孔板，每個樣本設復孔3個，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h和120 h時， 加入CCK-8顯色液，置于37 ℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱，孵育2 h。短暫振蕩，放入酶標儀中，于450 nm處檢測吸光度（OD）值。

1.3.5 Transwell 小室實驗檢測各組細胞中侵襲和遷移細胞數(shù)

侵襲細胞數(shù)：將Matrigel基質(zhì)膠移到4 ℃ 冰箱中過夜融化，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基8倍稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠覆蓋在Transwell小室上室中，將細胞密度調(diào)整至1×106個/mL，分別取100 μL加入Transwell小室，下室加入 RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后將小室取出，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗兩次后，用1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗凈殘留的染液，用棉棒輕輕擦去上室的細胞，在熒光顯微鏡下（40×）選取5個視野觀察細胞侵襲的情況。遷移細胞數(shù)：小室上室不用基質(zhì)膠包被，其余步驟同侵襲細胞數(shù)測定。細胞相對遷移率=不同處理的遷移細胞數(shù)/空白對照組的遷移細胞數(shù)×100%。

1.3.6 流式細胞儀檢測MM.1R細胞周期

轉(zhuǎn)染48 h和72 h后取5×105個細胞，PBS清洗一次，離心棄上清。每個樣本中加入500 μL PI/RNase 染料，室溫避光孵育15 min，在0.5 h內(nèi)上機檢測細胞周期情況。

1.3.7 流式細胞儀檢測MM.1R細胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h和72 h后取1×105個細胞，離心，棄去上清液。每管加入50 μL 1×Binding Buffer，重懸，陰性管不加任何染料，樣本管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。輕輕地震蕩溶液，放置在正常室溫下，避光孵育15 min。分別加入200 μL 1× Binding Buffer，在1 h內(nèi)流式細胞儀上機檢測細胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用 SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

2.1 多發(fā)性骨髓瘤細胞系中GDF15的表達水平

本研究根據(jù)不同的轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000 L1（7.5 μL、L2（10 μL）、L3（15 μL）以及jet PRIME P1（1 μL）、P2（2 μL）、P3（4 μL）、CK（本底）和陰性對照，分別轉(zhuǎn)染了多發(fā)性骨髓瘤MM.1R。再采用qRT-PCR方法分別檢測了上述6個組中GDF15的相對表達水平，結(jié)果與內(nèi)參作對比，GDF15在多發(fā)性骨髓瘤細胞株MM.1R中的相對表達水平不明顯。因此，將GDF15過表達和GDF15沉默對多發(fā)性骨髓瘤細胞功能的影響分別進行研究。但由于L3組的細胞狀態(tài)比P3好，本研究采用L3條件（Lipo3000 15 μL）進行后續(xù)實驗。見表1。

2.2 GDF15過表達對MM.1R細胞增殖能力的影響

CCK8結(jié)果顯示，經(jīng)過GDF15過表達組與陰性對照組的OD值進行比較，在72 h、96 h、120 h三個時間點，差異均有統(tǒng)計學意義［（0.611±0.060） vs （0.513±0.003），P<0.05］；［（0.933±0.006） vs （0.652±0.008），P<0.01］；［（1.291±0.067） vs （0.816±0.004），P<0.01］，提示GDF15基因在體外可促進細胞增殖，結(jié)果見圖1。

2.3 GDF15過表達對MM.1R細胞遷移、侵襲能力的影響

GDF15過表達組對MM.1R細胞的相對遷移率高于陰性對照組，但差異無統(tǒng)計學意義［（121.691±26.309） vs （118.012±15.490），t=0.269，P>0.05）］；GDF15過表達組對MM.1R細胞的侵襲能力高于陰性對照組［（350.80±98.86） vs （338.20±96.32）］，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見圖2。

2.4 GDF15 siRNA體外對MM.1R細胞增殖的影響

通過轉(zhuǎn)染3段不同的siRNA（siRNA-GDF15-45，siRNA-GDF15-741，siRNA-GDF15-533），感染MM.1R細胞后，采用qRT-PCR技術檢測GDF15基因在三組的相對表達量為1.026、0.228、0.674，與陰性對照組比較，siRNA-GDF15-741組對GDF15基因的干擾效果最明顯（P<0.05）。因此，本研究選擇siRNA-GDF15-741 作為有效的GDF15沉默載體轉(zhuǎn)染MM.1R細胞進行后續(xù)的研究。GDF15 siRNA轉(zhuǎn)染MM.1R細胞后，沉默組與陰性對照組的OD值進行比較，發(fā)現(xiàn)在72 h和96 h兩個時間點，差異均有統(tǒng)計學意義［（0.877±0.050） vs （0.975±0.039），P<0.05；（0.850±0.051） vs （1.017±0.010），P<0.01］，提示沉默GDF15在體外干預72 h和96 h可抑制細胞增殖。見圖3。

2.5 GDF15 siRNA對MM.1R細胞遷移、侵襲能力的影響

與陰性對照組相比，GDF15 siRNA組能顯著抑制MM.1R細胞的遷移能力，細胞相對遷移率的差異有統(tǒng)計學意義［（73.574±7.264） vs （118.723±17.960），t=4.661，P<0.05］；與陰性對照組相比（402.0±91.38），GDF15 siRNA組（237.4±47.33）能顯著抑制MM.1R細胞的侵襲能力（F=255.403，P<0.05）。見圖4。

2.6 GDF15 siRNA對MM.1R細胞周期與凋亡的情況

運用流式細胞術檢測細胞周期與凋亡的情況，結(jié)果顯示：48 h后，沉默組G0/G1 期細胞比例為（43.845±2.425）%，顯著高于陰性對照組的（36.505±2.199）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.152，P=0.034）；沉默組S期細胞比例為（33.880±2.418）%，顯著低于陰性對照組的（42.695±1.958）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=13.046，P=0.017）；72 h后，沉默組細胞G0/G1 期（41.185±2.538）%與陰性對照組（40.115±0.926）%比較，沉默組S期細胞（40.940±1.287）%與陰性對照組（41.095±1.322）%比較，差異均無統(tǒng)計學意義（F=5.974，27.244，P>0.05）。見圖5。48 h后，沉默組（6.510±2.559）%的總凋亡率與陰性對照組（5.320±0.919）%比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.808，P>0.05）；72 h后，沉默組（4.875±2.580）%的總凋亡率與陰性對照組（4.075±1.449）%比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.369，P>0.05），未見明顯促進MM.1R細胞凋亡作用。見圖6。

3 討? 論

GDF15屬于TGF-β超家族成員，是一種二聚體結(jié)構(gòu)的應激反應蛋白，參與了肌動蛋白細胞骨架的重組與轉(zhuǎn)移，它的生物學功能與TGF-β類似，在疾病的進展過程中發(fā)揮促進或抑制腫瘤生長的作用［6］。已有許多的研究證據(jù)表明，GDF15在多種腫瘤的增殖、遷移、侵襲、血管生成、細胞凋亡等致癌相關活動中發(fā)揮重要作用，但它在不同的腫瘤中可能執(zhí)行的生物學功能不同。

GDF15是一個具有抑癌與促癌作用的雙重身份基因［6］。一方面，在某些疾病中發(fā)揮促癌作用。ZHENG等人［7］研究發(fā)現(xiàn)，高表達GDF15可促進結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移，同時加速腫瘤細胞生長，體內(nèi)研究結(jié)果也表明，沉默GDF15顯著降低了來自結(jié)直腸癌細胞的異種移植瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在食管癌中GDF15表達上調(diào)，沉默GDF15后可以降低食管癌細胞的遷移和侵襲［8］。另外一方面，GDF15可發(fā)揮抑癌作用。HAN等人［9］研究發(fā)現(xiàn)，CXXC4可以通過上調(diào)GDF15促進胃癌細胞凋亡。在肺癌細胞中，過表達GDF15可以抑制p38-MAPK通路，導致凋亡增強［10］。在肝細胞癌的研究中，GDF15具有促進肝癌細胞凋亡和抗腫瘤的作用［11］。還有一種說法認為，GDF15在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期具有抑癌活性，而在腫瘤逐漸發(fā)展為惡性腫瘤時則成為腫瘤的啟動子［12］。CORRE等人［13］發(fā)現(xiàn)MM中GDF15與骨髓漿細胞直接接觸后，由骨髓間充質(zhì)干細胞分泌產(chǎn)生，進一步研究發(fā)現(xiàn)GDF15可增強惡性B淋巴細胞的腫瘤形成并具有自我更新潛能。TANNO等人［14］發(fā)現(xiàn)血清或腫瘤微環(huán)境中的GDF15能誘導MM腫瘤起始細胞的擴增和惡性轉(zhuǎn)化?？梢?，GDF15作為一種調(diào)節(jié)因子，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用，但對于不同疾病作用機制有明顯差異。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GDF15在MM患者血清中處于高表達水平［5］。那么GDF15基因能否作為MM治療的一個新型靶點，這需要進一步了解GDF15基因?qū)M細胞功能的影響。本研究通過體外構(gòu)建GDF15的過表達和沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MM.1R細胞株，觀察GDF15基因?qū)M細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等細胞生物學行為的影響。研究結(jié)果顯示：過表達GDF15在體外可促進MM細胞增殖，并隨著時間的推移細胞增殖速度更快；沉默GDF15表達后，在體外干預72 h和96 h可抑制MM細胞增殖，并能顯著抑制MM.1R細胞的遷移和侵襲能力；沉默GDF15還可以調(diào)節(jié)MM細胞周期進程，沉默GDF15 48 h后MM細胞G0/G1 期細胞比例顯著高于陰性對照組，S期細胞比例顯著降低，但未見明顯誘導MM.1R細胞凋亡作用。結(jié)果提示GDF15基因可能通過調(diào)節(jié)MM細胞增殖、遷移、侵襲和細胞周期等方式參與MM發(fā)展進程。

但本研究的結(jié)果與CORRE等人［13］在2012年的開展的一項研究結(jié)果有所不同，他們發(fā)現(xiàn)在無血清培養(yǎng)的條件下，不同濃度的GDF15蛋白與多發(fā)性骨髓瘤細胞株MM1.S、MOLP-6共培養(yǎng)，GDF15對MM1.S細胞沒有顯著的增殖效果，但對MOLP-6細胞增殖效果顯著。分析其原因，可能考慮：GDF15是骨髓基質(zhì)細胞與漿細胞直接接觸后產(chǎn)生的，它可以通過蛋白激酶B和SRY-SOX2依賴的方式增強多發(fā)性骨髓瘤細胞的致瘤潛能和自我更新能力［14］，也能通過激活c-Fos調(diào)控上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化基因，誘導腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］，還能通過 RANKL-Erk1/2 信號通路促進細胞分化［16］。由此可見，它的作用機制可能是多途徑、多方式的影響。此外，既往的大量研究也表明GDF15在腫瘤中扮演著促癌或抑癌的作用，結(jié)果不盡相同，這可能由于GDF15在不同的腫瘤中執(zhí)行的生物學功能不同，針對不同的細胞特征也會出現(xiàn)不同的作用結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)GDF15基因影響MM.1R細胞增殖、遷移和侵襲能力，并調(diào)節(jié)細胞周期。

下一步，本課題組將采用多個細胞株進一步了解GDF15基因?qū)M細胞功能的影響，也試圖從GDF15基因的上下游蛋白去尋找調(diào)控通路（如Akt / CREB1、GDF15/PD-L1等），驗證它們的相互作用，多途徑揭示其更為明確的作用機制，為MM開發(fā)新的治療靶點提供更多研究方向。

總之，GDF15基因影響多發(fā)性骨髓瘤細胞MM.1R的增殖、遷移和侵襲能力，并調(diào)節(jié)細胞周期，這可能會促進多發(fā)性骨髓瘤的進展。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-12-07 修回日期：2023-02-09）

（編輯：梁明佩）