王 佳， 馬麗媛， 母春蘭， 劉春蓮， 焦海燕

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)教育部生育力保持重點實驗室，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細胞生物學(xué)系，銀川 750004； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心，銀川 750004）

近年來，不育已成為世界范圍內(nèi)的重要健康問題之一。近50%的不育與男性因素有關(guān)[1]，而活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的睪丸組織損傷是其主要原因[2]。睪丸組織細胞質(zhì)膜中豐富的多不飽和脂肪酸易受ROS 攻擊[3-4]。當(dāng)機體內(nèi)過量的ROS 打破氧化-抗氧化平衡時，則會發(fā)生氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）。目前研究[5]發(fā)現(xiàn)，由ROS 導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide，LPO）積累是引發(fā)鐵死亡的關(guān)鍵因素。鐵死亡是一種鐵依賴的LPO 積累引起的調(diào)節(jié)性細胞死亡。不同于其他的細胞死亡形式，當(dāng)發(fā)生鐵死亡時，細胞內(nèi)Fe2+濃度升高，LPO 水平增加，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性降低[6]，線粒體萎縮，膜密度增大，嵴減少或消失[7]。有研究[8-9]顯示，男性不育患者精子中ROS 積累、GPX4 活性降低，推測OS 導(dǎo)致的生殖損傷與鐵死亡有關(guān)，但目前尚缺乏直接證據(jù)，且缺乏用于相關(guān)研究的細胞模型。因H2O2極易透過細胞膜，可與細胞內(nèi)的Fe2+通過Fenton 反應(yīng)使細胞產(chǎn)生大量ROS 和丙二醛（malondialdehyde，MDA）[10]，常被用于誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生OS。本研究擬用H2O2誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)TM3 細胞建立鐵死亡細胞模型，研究結(jié)果將為進一步研究鐵死亡對生殖細胞的影響及抗氧化藥物對雄性生殖細胞的保護作用及機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠睪丸間質(zhì)TM3 細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫（北納公司代理）；全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、MDA 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒與ROS檢測試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司；LPO 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；DMSO 購自美國Sigma 公司；50%H2O2購自四川金山制藥有限公司；青鏈霉素購自Solarbio 公司；FBS 胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；無水乙醇購自生工生物工程（上海）股份有限公司；GSH 過氧化物酶4 抑制劑（RSL3）與鐵死亡蛋白抑制劑（iFSP1）購自MCE 公司；Phen-Green-SK（25393）熒光探針購自Cayman 公司；MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) TM3 細胞復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況換液，待細胞長至80%～90%時，棄原液，用PBS 緩沖液沖洗，加入0.05%胰蛋白酶進行消化，后加入培養(yǎng)基終止消化，以1∶3 進行傳代處理，補足培養(yǎng)液，混勻，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 H2O2處理及細胞活力檢測 將細胞按5×105個/mL 濃度接種于96 孔板，100 μL/孔，復(fù)孔3 個，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞密度長至60%～70%時，向96 孔板中加入含不同H2O2濃度（0、1、2 mmol·L-1）的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)1 h。按上述方法進行鋪板及培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，向96 孔板中分別加入MTS 20 μL /孔，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h；取出96 孔板，在酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測各孔吸光度（OD）值。

1.2.3 OS 特征指標(biāo)測定 實驗分組為TM3 細胞常規(guī)培養(yǎng)組（T 組）和2 mmol·L-1H2O2處理TM3 細胞1 h 組（H2O2-T 組）。各組細胞去上清液，分別加入DCFH-DA 稀釋液（按1∶500 用無血清培養(yǎng)基稀釋），洗滌，消化收集細胞，500 μL PBS 重懸細胞后，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS 生成情況。將細胞用PBS 重懸，加入全蛋白裂解液，在冰浴條件下超聲破碎，離心取上清液，獲得蛋白原液。使用BCA 法檢測并計算待測樣本蛋白濃度。按照MDA 試劑盒說明書分別設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管與對照管，并按要求分別進行加樣，95 ℃水浴40 min 后冷卻并離心取上清液，在532 nm 處檢測OD 值并按照公式計算MDA 含量。組織中MDA 含量（nmol·mgprot-1）=（OD測定-OD對照）/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol·mL-1）÷待測樣本蛋白濃度（mgprot·mL-1）。使用SOD 測定試劑盒，分別設(shè)置對照孔、對照空白孔、測定孔和測定空白孔。按一定比例稀釋待測蛋白原液，并根據(jù)說明書進行加樣，37 ℃孵育20 min，在波長450 nm 處檢測OD 值，并根據(jù)公式計算SOD 抑制率，按照定義，在該反應(yīng)體系中SOD 抑制率達50%時所對應(yīng)的酶量為一個SOD 活力單位。最后得出SOD 活性。SOD 抑制率（%）=［（A對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）］/（A對照-A對照空白）×100%；SOD 活性（U·mgprot-1）=SOD 抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24 mL/0.02 mL）÷待測樣本蛋白濃度（mgprot·mL-1）。

1.2.4 LPO 水平測定 設(shè)置分組為T 組；H2O2-T組；1 μmol·L-1RSL3 處 理TM3 細 胞1 h 組（RSL3-T 組）；3 μmol·L-1iFSP1 處理TM3 細胞24 h 組（iFSP1-T 組）。按1.2.3 中方法提取細胞蛋白原液，并采用BCA 法測定蛋白濃度。使用LPO檢測試劑盒，分別設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管，按照說明書加樣，混勻后于45 ℃孵育60 min，離心后取上清，在586 nm 波長處測定OD 值，并根據(jù)公式計算LPO 含量。LPO 含量（μmol·gprot-1）=（A測定-A測定空白）/（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 μmol·L-1）÷待測樣本蛋白濃度（gprot·mL-1）。1.2.5 細胞鐵含量的測定 實驗按照1.2.4 進行分組。PBS 重懸細胞后，加入Phen-Green-SK 10 μmol·L-1，37 ℃避光孵育10 min，PBS 洗滌后重懸細胞，4%多聚甲醛固定細胞10 min，使用Hoechst 33342 孵育細胞5 min，棄去染液，使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。激光共聚焦觀察時選擇波長488 nm，觀察到綠色熒光。

1.2.6 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 實驗按照1.2.4進行分組。將細胞離心去上清后加固定液。用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3 次，2%鋨酸固定后再次用磷酸緩沖液沖洗。沖洗后的樣本經(jīng)過脫水、滲透、包埋，通過超薄切片機定位切片，使用2%醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色后，通過透射電鏡觀察、拍片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行作圖及統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，各獨立實驗均重復(fù)3次。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2 對TM3 細胞活力的影響

用0、1、2 mmol·L-1的H2O2分別處理TM3 細胞1 h，與0 mmol·L-1相比，用1、2 mmol·L-1H2O2處理后的細胞活力均降低（P均＜0.01），通過計算，IC50為2 mmol·L-1，見圖1。因此，本研究選擇2 mmol·L-1H2O2作用1 h 構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)TM3 細胞鐵死亡細胞模型。

圖1 不同H2O2 濃度對TM3 細胞活力的影響

2.2 H2O2 對TM3 細胞氧化水平的影響

與T 組相比，H2O2-T 組ROS 水平、MDA 含量均上升（P均＜0.001），SOD 活性下降（P＜0.001），見圖2。

圖2 H2O2 對TM3 細胞ROS、MDA 及SOD 水平的影響

2.3 H2O2 對TM3 細胞LPO 含量的影響

與T 組相比，H2O2-T 組、RSL3-T 組與iFSP1-T組LPO 含量均升高（P均＜0.001），見圖3。

圖3 H2O2 對TM3 細胞LPO 含量的影響

2.4 H2O2 對TM3 細胞內(nèi)鐵離子含量的影響

與T 組相比，H2O2-T 組、RSL3-T 組與iFSP1-T組熒光強度均減弱（P均＜0.001），見圖4。同RSL3-T 組與iFSP1-T 組相比，H2O2-T 組熒光強度變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

圖4 H2O2 對TM3 細胞內(nèi)鐵離子含量的影響

2.5 H2O2 對TM3 細胞線粒體形態(tài)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，T 組細胞線粒體結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)飽滿，線粒體嵴清晰明顯；而H2O2-T 組、RSL3-T 組與iFSP1-T 組細胞線粒體均出現(xiàn)類似的形態(tài)變化。H2O2-T 組細胞線粒體發(fā)生皺縮變小、嵴減少、外膜破裂的現(xiàn)象。RSL3-T 組與iFSP1-T 組細胞線粒體也明顯變小，嵴減少或消失，部分線粒體外膜破裂，見圖5。

圖5 透射電鏡觀察不同藥物處理下TM3 細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化（bar=1 μm）

3 討論

鐵死亡是一種鐵依賴的LPO 積累引起的非凋亡形式的調(diào)節(jié)性細胞死亡[5]。鐵死亡的發(fā)生是細胞內(nèi)脂質(zhì)ROS 生成與降解的平衡失調(diào)所致。H2O2是一種分子質(zhì)量較小的ROS，極易通過細胞膜，可與細胞中不穩(wěn)定鐵池中游離的Fe2+發(fā)生Fenton 反應(yīng)，產(chǎn)生高活性的羥基自由基，促使ROS 積累及膜脂過氧化[11-13]，導(dǎo)致LPO 積累。MDA是脂質(zhì)過氧化最豐富的副產(chǎn)品之一，也是OS 的常用生物標(biāo)記物。MDA 可通過傳播和放大氧化損傷，加速細胞死亡[14]。SOD 是生物體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，可清除氧自由基，被用于評估機體抗氧化能力。當(dāng)羥基自由基過多，就會導(dǎo)致磷脂的過度氧化，MDA 含量上升，SOD 活性下降[15]。LPO 濃度的增加引起膜不穩(wěn)定性，甚至破裂，產(chǎn)生其他有毒性衍生物，最終導(dǎo)致細胞鐵死亡[16]。本研究使用H2O2處理TM3 細胞后，ROS、MDA和LPO 水平均升高，SOD 活性降低。表明細胞在高水平ROS 作用下，脂質(zhì)過氧化水平升高，抗氧化能力降低，可能引發(fā)鐵死亡。

鐵死亡是鐵離子依賴的細胞死亡。本研究結(jié)果顯示，用H2O2、RSL3 與iFSP1 分別處理細胞后，細胞內(nèi)Fe2+含量較對照組均升高。RSL3 是一種靶向GPX4 的鐵死亡誘導(dǎo)劑[17-18]，可誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS 升高、LPO 增加而發(fā)生鐵死亡。鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）具有脂質(zhì)抗氧化劑的作用，對GPX4 缺失引起的鐵死亡有保護作用，iFSP1 可誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生[19]。本研究中，H2O2處理組同RSL3 與iFSP1 分別誘導(dǎo)的鐵死亡陽性細胞組相比，F(xiàn)e2+含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明H2O2干預(yù)組細胞Fe2+含量升高趨勢同鐵死亡誘導(dǎo)劑組一致，提示H2O2干預(yù)組細胞發(fā)生鐵死亡。鐵死亡的主要形態(tài)學(xué)特征是細胞中線粒體變小，線粒體膜密度增高，線粒體嵴減少或消失，外膜破裂[7]。本研究結(jié)果顯示，用H2O2、RSL3 與iFSP1 分別處理細胞后，線粒體均明顯變小，嵴減少或消失，部分線粒體外膜破裂，提示H2O2誘導(dǎo)了鐵死亡。

綜上所述，本研究利用H2O2干預(yù)小鼠睪丸間質(zhì)TM3 細胞成功誘導(dǎo)OS 后，細胞呈現(xiàn)ROS、MDA、LPO 及Fe2+含量升高、線粒體變小皺縮、嵴減少或消失、外膜破裂等鐵死亡特征。提示H2O2誘導(dǎo)小鼠TM3 細胞鐵死亡模型構(gòu)建成功。