黃 燦， 牛 陽， 南 一， 袁 玲， 竇紅莉， 姜文婕

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2. 寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004； 4. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046）

新型冠狀病毒感染是一種人群普遍易感的傳染病[1]。目前針對新型冠狀病毒的3CL 蛋白酶抑制劑Paxlovid 是由奈瑪特韋和利托那韋聯(lián)合使用的一種藥物，另一種藥物阿茲夫定屬于RNA 聚合酶抑制劑，可抑制病毒復(fù)制或清除病毒，但這兩種臨床用藥均會導(dǎo)致肝功能異常，腹瀉、味覺減退，消化不良、胃食管反流、嘔吐，頭痛、肌肉酸痛等不良反應(yīng)[2-3]。千金藤素（cepharanthine，CEP）是從傳統(tǒng)中藥白藥子的塊根中提取的，其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗溶血和促進抗體生成，提高機體免疫力的作用[4-5]，臨床上用于治療肺部炎癥和急性肺損傷（acute lung injure，ALI），同時作為白細(xì)胞增生藥治療輻射引起的白細(xì)胞減少癥[6-8]。研究[9]顯示，10 μmmol·L-1的CEP 可抑制冠狀病毒復(fù)制的倍數(shù)為15 393 倍。CEP 具有明顯的抗急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）活性的能力，其實驗療效優(yōu)于已獲批上市的瑞德西韋和帕羅韋德，可用于對抗COVID-19[10-12]，但其作用通路機制尚不明確。故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出CEP 化合物與疾病作用靶點進行聚類分析，同時對化合物-靶點進行分子對接，計算理化參數(shù)，評價其相互作用，以期為CEP 抑制COVID-19 的作用機制和藥物開發(fā)提供參考意義。

1 方法

1.1 CEP 靶點預(yù)測

借助PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），以“cepharanthine”為關(guān)鍵詞檢索其分子表達(dá)式、國際化學(xué)品標(biāo)識符及密鑰（international chemical identifier and key，InChIKey）、使用規(guī)范算法生成的線性描述代謝物結(jié)構(gòu)（canonicalization the simplified molecular-inout line-entry system，Canonical SMILES）、2D 結(jié)構(gòu)等信息，將Canonical SMILES 號導(dǎo)入SwissTargetPrediction 網(wǎng)站（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù) 測CEP的靶點。

1.2 預(yù)測COVID-19 疾病靶點，得出“藥物-疾病”交集靶點

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），以“novel coronavirus pneumonia”“new coronavirus pneumonia”和“COVID-19”為關(guān)鍵詞搜集疾病靶點，合并刪除重復(fù)項。在Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中分別輸入CEP 和COVID-19 疾病的作用靶點，得到“藥物-疾病”交集靶點。

1.3 構(gòu)建PPI

把交集靶點導(dǎo)入STRING 11.5（https：//cn.string-db.org/）構(gòu)建PPI，將tsv 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件中進行可視化。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclope-di a of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將1.2 得到的交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇物種為“Homo sapiens”，P＜0.05，其余為默認(rèn)值，進行GO 生物功能分析和KEGG 通路富集分析。利用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線繪圖工具，分別對GO 分析結(jié)果的生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）取P值最小的前10 個結(jié)果以及KEGG 的GeneInGO 值的前20 個結(jié)果作可視化處理。

1.5 成分-靶點分子對接

為進一步驗證CEP 治療COVID-19 的作用關(guān)系，選用已被確定為SARS-CoV-2 的功能宿主受體ACE2 和3CLpro 分別與CEP 和文獻(xiàn)[13]推薦藥物作分子對接。

2 結(jié)果

2.1 CEP 的靶點信息獲取情況

在PubChem 數(shù)據(jù)庫得到CEP 的分子表達(dá)式、InChIKey、Canonical SMILES、2D 結(jié)構(gòu)等信息（表1），并從SwissTargetPrediction 中預(yù)測到100個藥物靶點。

表1 千金藤素成分信息

2.2 疾病靶點預(yù)測結(jié)果

根據(jù)上述方法共得到4 735 個疾病靶點，與CEP 的靶點交集得到40 個共有靶點（圖1）。

圖1 CEP 與COVID-19 交集靶點圖

2.3 構(gòu)建PPI

將40 個交集靶點導(dǎo)入STRING 11.5 構(gòu)建PPI，將tsv 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件中刪除獨立節(jié)點，根據(jù)度值（Degree）對其作可視化處理（圖2），圖中包含38 個節(jié)點和224 條邊。同時由Cytoscape 3.9.0 內(nèi)置分析功能分析得到各蛋白之間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)，以Degree 大小為排序標(biāo)準(zhǔn)，篩選出核心蛋白，其中可見核心靶點：肉瘤（sarcoma，Src）基因、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶1（protein serine/threonine kinase 1，AKT1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等，見表2。

圖2 Cytoscape 3.9.0 軟件對PPI 作可視化處理

表2 排名前20 的交集靶點拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)

2.4 GO 生物功能分析和KEGG 通路富集分析

GO 分析一共得到333 個條目，其中BP240條，CC31 條，MF62 條。利用P值分別篩選出前10 條作可視化處理（圖3）。主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白激酶B 信號的正調(diào)控等生物學(xué)過程；BP 包括蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等；CC 有質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞質(zhì)等。KEGG 篩選得到133 條，根據(jù)GeneInGO 值（基因在GO 中的數(shù)量）篩出前20條通路（圖4），其中有19 個靶點富集在PI3K-AKT信號通路、11 個靶點在MAPK 信號通路、8 個靶點在coronavirus disease - COVID-19 信號通路。根據(jù)KEGG 以及核心靶點結(jié)果繪制coronavirus disease-COVID-19 信號通路（圖5）。

圖3 GO 功能分析結(jié)果柱狀圖

圖4 KEGG 通路富集分析?；鶜馀輬D

圖5 coronavirus disease-COVID-19 信號通路

2.5 分子對接結(jié)果

對重要靶點進行分子對接。對接分?jǐn)?shù)可評價結(jié)合活性：分?jǐn)?shù)＜-5.0 kcal·mol-1說明結(jié)合活性較好，分?jǐn)?shù)＜-7.0 kcal·mol-1則說明兩者之間有強烈的結(jié)合活性[14]，即配體與受體結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，能量越低，分子與靶點蛋白作用越突出[15]。首先，CEP 與前8 個核心靶點蛋白分子對接（表3），CEP與靶蛋白的最低結(jié)合能均＜-7.0 kcal·mol-1，說明配體與受體可以自發(fā)緊密結(jié)合，即CEP 與COVID-19 的靶點具有較好的結(jié)合性。同時，選取CEP 和文獻(xiàn)[13]推薦的5 種藥物分別與ACE2（PDB ID：1R42）和3CLpro（PDB ID：6LU7）進行分子對接（表4），CEP 與COVID-19 的兩個受體蛋白結(jié)合能量值明顯最低，兩者相互作用關(guān)系更緊密；分子對接結(jié)果可視化可見空間上，CEP 能夠很好地嵌入病毒的蛋白酶活性位點，蛋白構(gòu)象穩(wěn)定，說明CEP 與COVID-19 能夠穩(wěn)定結(jié)合（圖6）。

表4 藥物活性成分與COVID-19 核心靶點分子對接

3 討論

CEP 是抗COVID-19 和抗肺癌藥物，被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)為SARS-CoV-2 感染的候選治療藥物[16]。研究表明，CEP 可抑制SARS-CoV-2 病毒附著，阻止其進入細(xì)胞，對新出現(xiàn)的SARS-CoV-2B.1.351 變異具有很強的療效[17]，被用作SARS 的臨床前實驗[18]。CEP 也有良好的抗COVID-19 療效，其安全性得到一定程度的驗證[19]；作為治療COVID-19 候選藥物的CEP可作用于病毒復(fù)制酶，能抑制核因子-κB（NF-κB）的活化、脂質(zhì)過氧化、一氧化氮（NO）的產(chǎn)生和環(huán)氧合酶的表達(dá)，從而抑制病毒復(fù)制[20]。CEP 對人冠狀病毒OC43 和SARS-CoV 也具有抗病毒的特性[21]，Wang 等[22]通過小鼠體內(nèi)模型發(fā)現(xiàn)CEP 可降低IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎性因子的表達(dá)量，具有抗炎特性；Ohashi 等[23]構(gòu)建了療效數(shù)學(xué)預(yù)測模型，結(jié)果顯示靜脈注射CEP 和口服奈非那韋的聯(lián)合用藥對COVID-19 患者有良好的協(xié)同效應(yīng)，病毒清除比單獨使用奈非那韋早1.23 d，兩種藥物都顯示出抗病毒活性，其治療濃度在已獲批的人體適用濃度內(nèi)，兩者同時使用的抗病毒效果更佳。芝加哥大學(xué)Drayman 等[24]篩選評估了所有FDA 提名的候選藥物，發(fā)現(xiàn)CEP 抗新冠病毒的EC50（引起50%最大效應(yīng)的濃度，越低越好）只需0.1 mol·L-1，遠(yuǎn)低于其他候選藥，說明CEP的抗新冠病毒活性優(yōu)異。Fan 等[25]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法進一步解釋了CEP 抗COVID-19 的機制，認(rèn)為CEP 主要通過干擾細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)受感染細(xì)胞中大多數(shù)失調(diào)的基因和通路，從而發(fā)揮抗冠狀病毒效果；同時對數(shù)千種藥物進行了高通量篩選，發(fā)現(xiàn)中藥單體化合物CEP 具有較強的抗新冠病毒活性。Jiang 等[26]從分子水平證實了CEP 治療COVID-19 的潛在機制，為快速發(fā)現(xiàn)有效的COVID-19 治療藥物提供了新的線索和理論依據(jù)。因此，進一步研究CEP 對COVID-19 的潛在作用變得至關(guān)重要。

在核心靶點中，Src 蛋白是細(xì)胞質(zhì)中的酪氨酸專一性蛋白激酶，與質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)膜相結(jié)合后可調(diào)控細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化，并且其生成物可高度激活多種腫瘤細(xì)胞[27]。Src 激酶家族在病毒生命周期中起著關(guān)鍵作用，與SARS-CoV-2復(fù)制有關(guān)[28]。研究[29]表明，酪氨酸激酶Src 在SARSCoV-2 滴度上呈劑量依賴性降低。AKT1 是PI3K下游的重要蛋白，PI3K 激活后可募集活化AKT1進而激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞活化和細(xì)胞增殖，促進上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，會加重肺部炎癥損傷，釋放多種炎性因子[30]。EGFR 是上皮生長因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，與配體結(jié)合后能夠激活PI3K-AKT 信號傳導(dǎo)通路，繼而觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄，同時控制細(xì)胞增生、分化和生存。SARS-CoV-2感染時肺損傷可導(dǎo)致EGFR 過表達(dá)[31]，引發(fā)促炎反應(yīng)，易導(dǎo)致肺纖維化。古巴分子免疫中心的研究團隊使用抗EGFR 抗體治療COVID-19 患者，結(jié)果表明抗EGFR 抗體可改善疾病的炎癥，并抑制肺纖維化[32]。主要存在于真核生物中的mTOR是一種AKT1 激酶，可整合多類細(xì)胞刺激信號，調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子的表達(dá)，進而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、自噬與凋亡，促進物質(zhì)代謝，參與分化免疫細(xì)胞[33]。mTOR 及其組成的相關(guān)信號通路在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[34]，mTOR 能抑制人肺泡上皮細(xì)胞，刺激微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的表達(dá)進一步激活自噬，釋放炎性介質(zhì)從而調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞的損傷機制[35]。研究[36-37]表明，抑制mTOR 可誘導(dǎo)自噬細(xì)胞凋亡從而減少SARSCoV-2 引起的炎性反應(yīng)。可見CEP 作用于COVID-19 時，多靶點參與炎性反應(yīng)。

在GO 條目中BP 條目占比最大，為72.1%，CC 占9.3%，MF 占18.6%。CEP 治療COVID-19的GO 分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)磷酸化是重要的生物學(xué)過程，波士頓醫(yī)學(xué)院研究團隊發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2病毒會使肺細(xì)胞陷入混亂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化頻率發(fā)生異常變化，從而加速病毒繁殖，最終破壞細(xì)胞，造成廣泛的肺損傷[38]。SARS-CoV-2病毒的S 蛋白與ACE2 結(jié)合后，宿主細(xì)胞表面的其他蛋白會啟動病毒外膜與細(xì)胞膜融合，將病毒RNA 注入細(xì)胞，由此推斷CEP 可能通過阻止病毒入侵宿主細(xì)胞的膜融合，抑制SARS-CoV-2 病毒復(fù)制[39]。KEGG 通路富集分析可知，PI3K-AKT 信號通路在RNA 病毒復(fù)制和治療肺炎過程中可誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，上調(diào)抗病毒蛋白，直接抑制病毒復(fù)制，亦能激活先天免疫，清除病毒，有利于肺組織重構(gòu)[40]。同時，PI3K-AKT 信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，在低氧環(huán)境下PI3K 被激活使下游AKT 磷酸化，增強HIF-1 的活性，啟動下游靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[41]。研究[42]發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 感染可激活PI3K-AKT 調(diào)控下游的mTOR 蛋白激酶，抑制自噬，降低異常增殖的肺成纖維細(xì)胞的凋亡，從而促進肺纖維化，并促進病毒蛋白快速合成。也有研究[43]表明，SARS-CoV-2 病毒通過表面S 蛋白與ACE2 結(jié)合，借助網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進而在細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)體，且該途徑受PI3K-AKT 信號通路調(diào)控。同時，MAPK14、EGFR、MMP1、MMP3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PRKCA 這些與病毒感染、免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)相的蛋白富集在coronavirus disease-COVID-19信號通路上[44]，SARS-CoV-2 的S 蛋白表位在免疫球蛋白G（IgG）和受體結(jié)合期間體現(xiàn)出一定的親和力[45]，抗SARS-CoV-2 表面S 蛋白的IgG滴度主要參與嚴(yán)重的SARS-CoV-2 感染，與FcγRⅡA 受體結(jié)合促進細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）的表達(dá)，進一步激活PI3KAKT 信號通路；PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 為PI3K的催化亞基，主要通過PI3K-AKT 發(fā)揮生物學(xué)作用，PI3K 的下游蛋白甘油二酯（diacylglycerol，DAG）在Ca2+的協(xié)同下激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），引起級聯(lián)反應(yīng)，進行細(xì)胞應(yīng)答，并促使PKC 由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，觸發(fā)微生物表面的肌動蛋白聚合，由此產(chǎn)生的力可推動病毒穿過細(xì)胞質(zhì)，并啟動細(xì)胞吞噬作用，肌動蛋白又參與骨骼肌質(zhì)量的調(diào)節(jié)，故感染SARS-CoV-2 又多有關(guān)節(jié)肌肉酸痛的癥狀。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)多種SYK 和PI3K 抑制劑可抵消抗S 免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[46]。ACE2 可通過Src 家族通路、PI3K 通路，分別激活NF-κB 通路、P38（MAPK14）信號通路，進而上調(diào)MMP1、MMP3 等炎性因子的表達(dá)，過度激活炎性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，引起肺組織損傷，從而導(dǎo)致ALI 和嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。故推測CEP 作用于COVID-19 時，主要通過PI3K-AKT、coronavirus disease-COVID-19 信號通路調(diào)控炎性反應(yīng)，同時有大量靶標(biāo)蛋白參與細(xì)胞增殖、凋亡與自噬，抑制病毒復(fù)制，參與肺組織重構(gòu)，從而改善呼吸系統(tǒng)環(huán)境，提示了新冠病毒感染的關(guān)鍵機制和途徑。

ACE2 是新冠病毒侵入細(xì)胞的受體蛋白[47]，其遺傳機制是COVID-19 基礎(chǔ)研究及防診治的關(guān)鍵[48]，血漿中ACE2 蛋白水平在遺傳上與COVID-19 重癥有遺傳正相關(guān)且具有增加COVID-19 感染、住院和重癥風(fēng)險的因果效應(yīng)。ACE2 可以保護肺部免受ALI，SARS-CoV 的S 蛋白與ACE2 結(jié)合，則ACE2 下調(diào)，即刻出現(xiàn)ALI 和肺水腫，產(chǎn)生大量炎性因子進而促使呼吸衰竭。SARS-CoV-2產(chǎn)生的主要蛋白酶3CLpro 是冠狀病毒復(fù)制所必需的酶，在病毒感染與復(fù)制中發(fā)揮著重要作用，可作為有效的抗病毒藥物靶點[49]。有研究表明，3CLpro 切割位點在SARS、MERS 病毒和2019-nCoV 冠狀病毒中屬“高度保守”區(qū)域，對冠狀病毒的變異株保有高度活性，加上人類在HIV 蛋白酶抑制劑上的成功經(jīng)驗，認(rèn)為3CLpro 是廣譜抗冠狀病毒藥物的有效靶點，3CLpro 抑制劑能夠有效抑制病毒的感染與復(fù)制[50]，發(fā)揮抗病毒的作用。SARS-CoV-2 病毒的Polyprotein 1a 和Polyprotein 1ab 在多個位點被3CLpro 切割，產(chǎn)生對病毒復(fù)制至關(guān)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，因此阻止這種切割會抑制病毒復(fù)制和增殖[51]，根據(jù)分子對接圖的結(jié)合位點可知，CEP 能與其活性氨基酸殘基結(jié)合，并深入其結(jié)合口袋，由此推斷CEP 可能對3CLpro 具有一定抑制作用。本研究將以上兩個COVID-19重要受體分別與CEP 和5 種抗病毒藥物做分子對接驗證，顯示CEP 與COVID-19 受體均能緊密結(jié)合，結(jié)合能分別為-9.5 kcal·mol-1和-8.4 kcal·mol-1，因此更有優(yōu)勢，穩(wěn)定性最佳。故推測，CEP 在治療COVID-19 中具有潛在的成藥性，能夠發(fā)揮積極作用，但需要進一步的藥效學(xué)驗證。

綜上可知，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測CEP 可能通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT、coronavirus disease-COVID-19 等信號通路從而干預(yù)COVID-19 的作用，分子對接驗證顯示CEP 能和COVID-19 的兩大主要受體緊密聯(lián)系，有利于病毒抑制劑的研發(fā)，希望能為今后的基礎(chǔ)實驗和臨床實驗提供參考。