楊治倫， 陳小江， 陳飛飛， 原茜倩， 馬全瑞， 秦 毅

（寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，銀川 750004）

小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中固有的免疫效應細胞，其在許多神經疾病中可介導產生神經炎癥[1]，造成二次損傷[2]，這一過程往往伴隨著細胞焦亡的發(fā)生[3]，其通過介導胞膜穿孔來加劇神經炎性反應[4-5]。因此，尋找可以有效抑制細胞焦亡的藥物具有重要的臨床意義。研究[6]表明，黃芪提取物黃芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）可以有效抑制缺血性腦損傷大鼠模型中與焦亡發(fā)生相關的NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）、胞膜穿孔蛋白D（gasdermin D，GSDMD）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β 產生。但是，AS-IV 對于小膠質細胞是否有相似的抑制作用尚未可知。為了進一步探究其是否存在抑制作用，本研究以AS-IV 干預小膠質細胞系（BV2），探討不同濃度AS-IV 對凝血酶激活的小膠質細胞表達焦亡相關因子的影響，并對相關機制進行分析，以期為AS-IV 應用于臨床治療神經炎性反應提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠小膠質細胞BV2 細胞系購于廣州賽庫生物技術有限公司；AS-IV 標準品（20 mg，純度≥98%）購于北京索萊寶科技有限公司；凝血酶（T4648-1KU）購于美國Sigma 公司；ECL 化學發(fā)光底物試劑盒購于江蘇凱基生物技術有限公司；凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）、Caspase-1、GSDMD 多克隆抗體、Cy3 熒光Rabbit 二抗、HRP標記Mouse 二抗、HRP 標記Rabbit 二抗均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；NLRP3 多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；β-actin單克隆抗體購于英國Abcam 公司；北美胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于美國Gibco 公司；小鼠IL-1β 及IL-18 ELISA 試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將BV2 細胞培養(yǎng)在DMEM 高葡萄糖全培養(yǎng)基［含有10%熱滅活FBS、1%青鏈霉素混合液（100×），青霉素10 kU·mL-1，鏈霉素10 mg·mL-1］中，并置于37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每24 h 按照1∶3 比例傳一代。凝血酶藥物濃度參照Ye 等[7]測定的藥物實驗濃度，選定適宜的凝血酶濃度范圍，加藥觀察BV2 細胞狀態(tài)，最終確定以20 U·mL-1凝血酶作為制備模型濃度；AS-IV 藥物濃度參照Yu 等[8]作用BV2 細胞的藥物實驗濃度，并利用CCK-8 法檢測藥物濃度范圍內的細胞活力，最終確定以1、5、10 μmol·L-1作為AS-IV 干預濃度。

觀察所培養(yǎng)細胞的狀態(tài)，待其穩(wěn)定后，將BV2 細胞隨機分為5 組：Control 組（正常對照組）、凝血酶組（20 U·mL-1）、1 μmol·L-1AS-IV 組（20 U·mL-1凝血酶+1 μmol·L-1AS-IV）、5 μmol·L-1AS-IV 組（20 U·mL-1凝血酶+5 μmol·L-1AS-IV）、10 μmol·L-1AS-IV 組（20 U·mL-1凝 血 酶+10 μmol·L-1AS-IV）。其中AS-IV 組的AS-IV 與凝血酶同時加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h。

1.3 免疫印跡檢測BV2 細胞ASC、NLRP3、Caspase-1、gasdermin D-N 端（GSDMD-N）的表達

將BV2 細胞按照1.2 所述分組后，在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h 后，消化并離心，取出細胞沉淀，加入裂解液裂解細胞以獲得胞內蛋白，低溫離心（12 000 r·min-1，4 °C，10 min）后吸出上清，利用BCA 法測得總蛋白濃度，加入適量上樣緩沖液后95 ℃加熱10 min 使其變性，電泳、轉膜后，5%牛奶4 °C 封閉過夜，加入ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、β-actin（稀釋比例均為1∶1 000）抗體4 °C 過夜，回收一抗，用TBST 溶液洗滌5 次，加入HRP 二抗（1∶4 000）搖床孵育1 h后滴加ECL 發(fā)光液行化學發(fā)光顯色，以β-actin為內參蛋白。利用Image J 軟件進行灰度值分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.4 免疫熒光染色檢測BV2 細胞ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的表達

將BV2 細胞以1×105個/孔接種至已含有玻片的24 孔板中進行細胞爬片并培養(yǎng)24 h，再按照1.2 所述分組加藥培養(yǎng)24 h，對細胞進行固定（4%多聚甲醛，15 min），以0.25% 曲拉通X-100的PBS 溶液通透20 min，PBS 浸洗3 次，以封閉用正常羊血清室溫封閉30 min；分別滴加ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 抗體（1∶200），4 °C孵育過夜，PBS 浸洗5 次；加入Cy3 紅色熒光標記二抗（1∶300），37 °C 避光孵育1 h，PBS 浸洗5次；最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下（×100）隨機選取每組3 個視野攝片，并用Image J 軟件進行區(qū)域平均熒光強度測定，最終結果與Control 組相比，獲得相對熒光強度比值。

1.5 ELISA 法測定細胞培養(yǎng)液中IL-1β 及IL-18 的含量

將BV2 細胞按1×105個/孔密度接種至24孔板培養(yǎng)24 h，隨后按照1.2 所述分組加藥培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后，將不同組細胞培養(yǎng)液取出，以1 000×g離心15 min。將含有抗體的酶標板分別設置空白孔、標準孔及待測樣品孔。隨后按試劑盒說明書進行操作，直至加完終止液后，在20 min 內測量波長在450 nm 處的OD 值，并以標準曲線求得各待測樣品孔內的實際濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用OriginPro 2021 軟件進行數(shù)據分析及繪圖。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫印跡法檢測AS-IV 對BV2 細胞焦亡相關因子表達的影響

免疫印跡檢測顯示，凝血酶組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 與Control 組相比，各蛋白表達水平均升高（P均＜0.05）；與凝血酶組相比，1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組中ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 各蛋白表達水平均有不同程度下降（P均＜0.05）；與1 μmol·L-1AS-IV 組比較，5、10 μmol·L-1AS-IV 組ASC、NLRP3 表達均降低（P均＜0.05），而5、10 μmol·L-1AS-IV 兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；此外，Caspase-1、GSDMD-N 在1、5、10 μmol·L-1AS-IV 實驗組間差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見圖1。

圖1 免疫印跡法檢測AS-IV 對BV2 細胞焦亡相關因子表達的影響（n=3）

2.2 免疫熒光染色法檢測AS-IV 對BV2 細胞焦亡相關因子表達的影響

免疫熒光染色顯示，Control 組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的熒光Cy3 紅色熒光染料著色細胞少，熒光強度低；與Control 組相比，凝血酶組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的著色細胞明顯增多，熒光強度增高（P均＜0.05）；與凝血酶組比較，1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 的著色細胞均減少，熒光強度均降低（P均＜0.05）；其中，ASC、NLRP3、GSDMD-N 在5、10 μmol·L-1AS-IV 組中的熒光強度較1 μmol·L-1AS-IV 組均降低（P均＜0.05），而5、10 μmol·L-1AS-IV 兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；此外，Caspase-1 在1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組中差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見圖2。

圖2 免疫熒光染色法檢測AS-IV 對BV2 細胞焦亡相關因子表達的影響

2.3 ELISA 法檢測AS-IV 對BV2 細胞培養(yǎng)液中IL-1β 與IL-18 含量的影響

ELISA 結果顯示，與Control 組比較，凝血酶組的培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18 的含量均上升（P均＜0.05）；1、5、10 μmol·L-1AS-IV 組培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18 含量均低于凝血酶組（P均＜0.05），其中，5、10 μmol·L-1AS-IV 組的培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18 含量均低于1 μmol·L-1AS-IV 組（P均＜0.05），而5、10 μmol·L-1AS-IV 組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見圖3。

圖3 ELISA 檢測AS-IV 對BV2 細胞培養(yǎng)液中IL-1β與IL-18 含量的影響（n=5）

3 討論

由于目前對神經炎癥所產生的不良后果尚無有效的方式或藥物進行治療[9]，故如何有效減少神經退行性疾病所伴隨的神經炎性反應受到越來越多學者的關注。作為CNS 中炎性因子的主要釋放來源，小膠質細胞在過去的研究中被證實可調控神經炎性反應的強弱[2]。因此，很多研究試圖通過干預小膠質細胞的反應，從源頭減少炎性因子的分泌。在小膠質細胞產生炎性反應并釋放炎性因子的過程中，需要借助多條炎性信號通路來實現(xiàn)，其中細胞焦亡通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條炎性反應通路[10]。該通路由核轉錄因子-κB調控促使ASC、NLRP3、pro-Caspase-1 組成的三聚體（NLRP3 炎性小體）切割產生Caspase-1，隨后Caspase-1 切割GSDMD 致使胞膜穿孔[5]，使細胞將內容物釋放到周圍環(huán)境中產生強烈的炎性反應。因此，若能有效抑制小膠質細胞發(fā)生細胞焦亡，便可以減少其所導致的神經炎性反應，為臨床治療神經炎癥提供新思路。

黃芪在以往的炎性模型研究中表現(xiàn)出較強的抗炎能力，如高糖誘導的血管內皮炎性模型[11]，寡聚Aβ 誘導的阿爾茨海默病模型[12]等。利用AS-IV 干預由脂多糖（LPS）激活的小膠質細胞，結果顯示，AS-IV 可以減少小膠質細胞分泌炎性因子，并促使其由M1 型向M2 型轉化[8]。另外，鄭心甜等[13]在腦缺血大鼠模型上也驗證了這一結果。上述研究表明，AS-IV 可以抑制小膠質細胞產生的炎性反應，但其對于焦亡通路是否起到了抑制作用尚未可知。為此，本研究利用凝血酶來激活小膠質細胞并使用AS-IV 進行干預，觀察其焦亡通路相關因子的表達是否有所下降，來驗證AS-IV 對小膠質細胞發(fā)生焦亡是否有抑制作用，以期將來對AS-IV 的抗炎機制做進一步闡釋。

本研究免疫印跡結果顯示，與Control 組比較，凝血酶組傳導焦亡信號的主要蛋白因子（ASC、NLRP3、Caspase-1）的表達量升高，與Ye 等[7]所測結果相似，這說明凝血酶可以刺激小膠質細胞產生焦亡相關因子。但處在焦亡通路下游的GSDMD 蛋白是近年來新發(fā)現(xiàn)的蛋白[5]，目前在凝血酶模型中未見對此類蛋白的測定。通常，此蛋白被剪切后的N 端（GSDMD-N）充當著細胞焦亡執(zhí)行者的角色，這是直接導致焦亡發(fā)生的蛋白，因此測定其表達量的變化，便可以證明細胞焦亡的發(fā)生。本研究測定GSDMD-N 在凝血酶模型中也有同樣的上升趨勢，說明凝血酶模型中小膠質細胞會發(fā)生由GSDMD-N 介導的胞膜穿孔。在經過AS-IV 干預后，小膠質細胞體內焦亡相關因子（ASC、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N）的表達量與凝血酶組相比均有下降，并且相較于1 μmol·L-1AS-IV組，5、10 μmol·L-1AS-IV 組中ASC、NLRP3 的下降程度更加明顯。與免疫印跡結果相似的是，在免疫熒光結果中，凝血酶組的小膠質細胞著色較多、熒光強度高，并且熒光強度較高的細胞有明顯的聚集性，推測當小膠質細胞發(fā)生焦亡后，其釋放的炎性因子會刺激周圍未發(fā)生焦亡的細胞活化，促使其相互聚集，繼而進一步產生級聯(lián)放大反應。而使用AS-IV 干預后，熒光強度降低，著色細胞減少，原本在凝血酶組中的聚集現(xiàn)象也明顯減少，并且5、10 μmol·L-1AS-IV 組中的ASC、NLRP3、GSDMD-N 熒光強度較1 μmol·L-1AS-IV組更低，說明5、10 μmol·L-1AS-IV 可有效抑制小膠質細胞中焦亡相關因子的上升，推測這類蛋白表達量的總體下降可能與AS-IV 調控核轉錄因子-κB 的表達有關。以上實驗結果說明，AS-IV可有效抑制小膠質細胞發(fā)生細胞焦亡及與焦亡相關的炎性反應，并且較高濃度的AS-IV 可以起到更強的抗焦亡作用。此外，在細胞焦亡通路的下游，Caspase-1 除誘導GSDMD 蛋白發(fā)生切割致使胞膜穿孔外，其另一個主要作用是剪切pro-IL-1β 與pro-IL-18 形成IL-1β 與IL-18 并釋放到胞外[14]。IL-1β 與IL-18 作為關鍵的促炎因子，參與多種炎性反應的發(fā)生。對此，本研究利用ASIV 干預凝血酶活化的小膠質細胞后，測定其培養(yǎng)液中IL-1β 與IL-18 分泌量的變化發(fā)現(xiàn)，其分泌量均低于凝血酶組，并且與1 μmol·L-1AS-IV組比較，5、10 μmol·L-1AS-IV 組培養(yǎng)液中IL-1β與IL-18 的含量更低。說明AS-IV 在抑制小膠質細胞發(fā)生焦亡的過程中，可有效地減少其向培養(yǎng)液中分泌炎性因子，特別是Caspase-1 的減少會使被剪切后產生的IL-1β 與IL-18 更少，因此其分泌量下降。

綜上所述，AS-IV 能夠有效抑制凝血酶激活的小膠質細胞表達焦亡相關蛋白，同時也降低其下游相關炎性因子的分泌，表明AS-IV 抑制活化的小膠質細胞發(fā)生焦亡可能是其抑制小膠質細胞炎性反應的機制之一。